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Neurociência

Zebrafish लार्वा में कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार रिकॉर्डिंग का उपयोग करके एक दो-फोटॉन लेज़र और उसके मूल्यांकन का उपयोग करके एक न्यूरॉन जनसंख्या का पृथक

Published: June 02, 2018
doi:
10.3791/57485
,
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics,SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

Summary

यहां, हम Zebrafish लार्वा से एक दो फोटॉन लेजर द्वारा न्यूरॉन्स के एक आनुवंशिक रूप से लेबल उपजनसंख्या ablate करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

Abstract

व्यवहार में न्यूरॉन्स की एक उपजनसंख्या की भूमिका की पहचान करने के लिए, यह जीवित पशुओं में अपनी गतिविधि को अवरुद्ध करने के परिणामों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है. लेजर न्यूरॉन्स के पृथक इस प्रयोजन के लिए एक प्रभावी तरीका है जब ंयूरॉंस चुनिंदा फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल कर रहे हैं । वर्तमान अध्ययन में, लेजर के लिए प्रोटोकॉल ablating एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर न्यूरॉन्स की एक उपजनसंख्या और उसके कार्यात्मक और व्यवहार परिणामों के परीक्षण वर्णित हैं. इस अध्ययन में, zebrafish लार्वा में उलझकर कब्जा व्यवहार एक अध्ययन मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है । pretecto-हाइपोथैलेमस सर्किट इस नेत्रहीन संचालित शिकार आबाद व्यवहार को पकड़ने के लिए जाना जाता है । Zebrafish pretectum लेजर ablated थे, और hypothalamus के अवर पालि में न्यूरॉन गतिविधि (ILH; pretectal प्रोजेक्शन के लक्ष्य) की जांच की गई । शिकार कब्जा व्यवहार के बाद pretectal पृथक भी परीक्षण किया गया था ।

Introduction

समझने के लिए कैसे व्यवहार मस्तिष्क में न्यूरॉन गतिविधि से पैदा होता है, यह है कि व्यवहार की पीढ़ी में शामिल कर रहे हैं तंत्रिका सर्किट की पहचान करने के लिए आवश्यक है. लार्वा मंच पर, zebrafish व्यवहार के साथ जुड़े मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श पशु मॉडल प्रदान करता है क्योंकि उनके छोटे, पारदर्शी दिमाग के एक व्यापक क्षेत्र में एक सेलुलर संकल्प पर न्यूरॉन गतिविधि की जांच करने के लिए यह संभव बनाने मस्तिष्क जबकि व्यवहार1अवलोकन । विशिष्ट ंयूरॉंस में ंयूरॉन गतिविधि के इमेजिंग के आविष्कार के माध्यम से संभव हो गया है आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम (सीए) संकेतक (GECIs) जैसे GCaMP2। GCaMP ट्रांसजेनिक zebrafish व्यवहार के साथ कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट से संबद्ध करने के लिए उपयोगी साबित किया है पशु बर्ताव में सीए इमेजिंग3।

जबकि सीए इमेजिंग ंयूरॉंस गतिविधि और व्यवहार के बीच सहसंबंध प्रदर्शित कर सकते हैं, के लिए भिंन दिखाने के लिए, ंयूरॉन गतिविधि का दमन और उसके परिणाम (s) व्यवहार पर परीक्षण महत्वपूर्ण कदम हैं । वहां विभिंन तरीकों से इस लक्ष्य को प्राप्त कर रहे हैं: आनुवंशिक उत्परिवर्तन कि बदल विशिष्ट तंत्रिका सर्किट4, विशिष्ट ंयूरॉंस में neurotoxins की अभिव्यक्ति5,6, जैसे halorhodopsin7के रूप में optogenetic उपकरण का उपयोग करें, और लक्षित ंयूरॉंस की लेजर पृथक8,9। लेजर पृथक विशेष रूप से विशिष्ट ंयूरॉंस की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या में गतिविधि को नष्ट करने के लिए अनुकूल है । न्यूरॉन्स की हत्या द्वारा न्यूरॉन्स गतिविधि के अपरिवर्तनीय उन्मूलन व्यवहार परिणामों का आकलन करने की सुविधा.

एक दिलचस्प व्यवहार है कि zebrafish में लार्वा चरण में मनाया जा सकता है शिकार पर कब्जा (चित्रा 1ए) है । यह नेत्रहीन-निर्देशित, लक्ष्य निर्देशित व्यवहार दृश्य तीक्ष्णता10, visuomotor परिवर्तन11,12,13, दृश्य धारणा और मांयता के अध्ययन के लिए एक अनुकूल प्रयोगात्मक प्रणाली प्रदान करता है ऑब्जेक्ट्स14,15,16,17,18, और निर्णय लेने19। कैसे शिकार शिकारियों द्वारा मांयता प्राप्त है और कैसे शिकार का पता लगाने के लिए शिकार को पकड़ने के व्यवहार की ओर जाता है neuroethology20में एक केंद्रीय प्रश्न रहा है । इस पत्र में, हम pretecto की भूमिका पर ध्यान केंद्रित-हाइपोथैलेमस pretectum में एक नाभिक के अनुमानों द्वारा गठित सर्किट (नाभिक pretectalis superficialis पार्स magnocellularis, इसके बाद, बस pretectum के रूप में नोट) ILH । लेजर-pretectum के पृथक शिकार पर कब्जा गतिविधि को कम करने के लिए दिखाया गया था और ILH है कि दृश्य शिकार धारणा के साथ जुड़ा हुआ है में ंयूरॉन गतिविधि को समाप्त21। यहां, लेजर पृथक प्रदर्शन और इसके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग Ca2 + इमेजिंग और zebrafish लार्वा में व्यवहार रिकॉर्डिंग वर्णित हैं ।

Protocol

1. एक दो फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर न्यूरॉन्स की एक उपआबादी का पृथक नोट: यदि उपयोगकर्ता पृथक के बाद Ca इमेजिंग करने पर योजना बनाते हैं, तो UAShspzGCaMP6s लाइन21का उपयोग करें । यदि उप…

Representative Results

विशिष्ट ंयूरॉंस या तो EGFP या GCaMP6s, जिनकी अभिव्यक्ति Gal4 लाइनों में संचालित थे के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल थे । एक Gal4 लाइन gSAIzGFFM119B pretectal क्षेत्र (magnocellular सतही pretectal नाभिक), और घ्राण बल्ब न्यूरॉन्स की एक उपआबा?…

Discussion

हालांकि दो फोटॉन लेजर विशेष रूप से ablate व्यक्तिगत ंयूरॉंस के लिए एक उत्कृष्ट स्थानिक संकल्प किया है, महान सावधानी गर्मी के कारण मस्तिष्क ऊतक पर किसी भी अवांछित क्षति से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । पृथक …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इन अध्ययनों से MEXT, JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP25290009, JP25650120, JP17K07494, और JP17H05984 से प्राप्त अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

NuSieve GTG Agarose Lonza Cat.#50080 low-melting temperature agarose
6 cm petri dish FALCON Product#:351007
dissecting needle AS ONE Corporation Cat. No. 2-013-01 https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP Carl Zeiss two-photon laser scanning microscope
W Plan-Apochromat 63x/1.0 Carl Zeiss 63X objective lens
Imager.Z1 Carl Zeiss an epi-fluorescence microscope
ZEN Carl Zeiss Image acquisition software for confocal microscopes
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth Molecular Probes Catalogue # S-24732 Used as a recording chamber in Ca imaging
Imageing Chambers Grace Bio-Labs CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 Used as a behavioral recording chamber
surgical knife MANI Ophthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics model:C11440-22CU a scientific CMOS camera
HCImage Hamamatsu Photonics image acuisition software
Hard Disk Recording module Hamamatsu Photonics An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time
SZX7 Olympus stereoscope
DF PL 0.5X Olympus objective lens for SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio FLIR Systems, Inc. Product No. GS3-U3-41C6NIR-C CMOS camera
XIMEA xiQ camera XIMEA Product No. MQ042RG-CM CMOS camera
a ring LED light CCS Model: LDR2-100SW2-LA White LED
Nylon mesh 32µm Tokyo Screen N-No.380T http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon mesh 13µm Tokyo Screen N-No. 508T-K http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron aperture Tokyo Screen http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. dry beer yeast
LabVIEW National Instruments an integrated development environment for programming
Mai-Tai HP Spectra Physics  two-photon laser 
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Referências

  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neurociência. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
  24. . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  27. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
  28. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

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Muto, A., Kawakami, K. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57485, doi:10.3791/57485 (2018).
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