الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد
Summary
نقدم هنا، بروتوكول يجتذ يتدنى وراثيا مسماة الخلايا العصبية بليزر اثنين-فوتون من اليرقات الزرد.
Abstract
لتحديد دور يتدنى من الخلايا العصبية في السلوك، من الضروري اختبار المترتبة على عرقلة نشاطها في الحيوانات الحية. التذرية الليزر الخلايا العصبية طريقة فعالة لهذا الغرض عندما تتم تسمية الخلايا العصبية بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. ويرد في الدراسة الحالية، والبروتوكولات الخاصة بالليزر أبلاتينج يتدنى من الخلايا العصبية باستخدام مجهر اثنين-فوتون واختبار نتائجه الوظيفية والسلوكية. في هذه الدراسة، يتم استخدام السلوك التقاط الفريسة في اليرقات الزرد كنموذج دراسة. حلبة بريتيكتو طائي المعروف أن تكمن وراء هذا فريسة يحركها بصريا اصطياد السلوك. بريتيكتوم الزرد أبلاتيد الليزر، وجرى النظر في نشاط الخلايا العصبية في الفص السفلي من تحت المهاد (إيله؛ والهدف من الإسقاط بريتيكتال). كما تم اختبار السلوك التقاط فريسة بعد التذرية بريتيكتال.
Introduction
لفهم كيفية السلوك ينشأ عن نشاط الخلايا العصبية في الدماغ، من الضروري تحديد الدوائر العصبية التي تشارك في توليد هذا السلوك. مرحلة اليرقات، يوفر الزرد نموذج حيوان مثالي لدراسة وظيفة المخ المرتبطة بالسلوك لأن ادمغتهم الصغيرة وشفافة تجعل من الممكن للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية في دقة خلوية في منطقة واسعة من المخ أثناء مراقبة السلوك1. تصوير نشاط الخلايا العصبية في الخلايا العصبية المحددة أصبح ممكناً من خلال اختراع وراثيا المرمزة الكالسيوم (Ca) المؤشرات (جيسيس) مثل جكامب2. جكامب الزرد المعدلة وراثيا أثبتت أن تكون مفيدة لربط الدارة العصبية الوظيفية بالسلوك عن طريق إجراء تصوير Ca في سلوك الحيوانات3.
بينما يمكن إثبات Ca تصوير العلاقات المتبادلة بين نشاط الخلايا العصبية والسلوك، لإظهار العلاقة السببية، قمع نشاط الخلايا العصبية، واختبار consequence(s) شأن سلوك خطوات هامة. هناك طرق مختلفة تحقيق هذا الهدف: استخدام الطفرات الوراثية أن يغير الدوائر العصبية محددة4، التعبير عن أعصاب في الخلايا العصبية المحددة5،6، استخدام أدوات أوبتوجينيتيك مثل هالورهودوبسين7، و ليزر تذرية من الخلايا العصبية المستهدفة8،9. التذرية الليزر مناسبة خاصة للقضاء على النشاط في عدد قليل نسبيا من الخلايا العصبية المحددة. القضاء الذي لا رجعة فيه من نشاط الخلايا العصبية عن طريق قتل الخلايا العصبية يسهل تقييم الآثار السلوكية.
هو واحد من السلوك المثيرة للاهتمام التي يمكن ملاحظتها في مرحلة اليرقات في الزرد فريسة الاستيلاء (الشكل 1أ). يوفر هذا السلوك الموجهة بشكل مرئي، والموجه بهدف نظام تجريبي مواتية لدراسة البصر10والتحول فيسوموتور11،،من1213، الإدراك البصري والاعتراف كائنات14،،من1516،،من1718، وصنع القرار19. كيف المسلم فريسة من الحيوانات المفترسة وكيف يؤدي الكشف عن فريسة فريسة اصطياد السلوك كانت مسألة مركزية في نيوروثولوجي20. في هذه الورقة، علينا أن نركز على دور الدارة بريتيكتو طائي شكلتها إسقاطات نواة في بريتيكتوم (نواة بريتيكتاليس السطحية فارس ماجنوسيلولاريس، يشار إليها فيما بعد، ببساطة ولوحظ بريتيكتوم) إلى إيله. وأبدى التذرية الليزر بريتيكتوم للحد من نشاط التقاط الفريسة وإلغاء نشاط الخلايا العصبية في إيله الذي يرتبط ب تصور فريسة البصرية21. هنا، بروتوكولات لإجراء الليزر التذرية واختبار أثره استخدام Ca2 + تصوير وتسجيل السلوكية في الزرد يرد اليرقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبالرغم من أن الليزر اثنين-فوتون قرار مكانية ممتازة ليجتذ الخلايا العصبية الفردية على وجه التحديد، ينبغي اتخاذ الحذر الشديد لتجنب أي ضرر غير مرغوب فيها في أنسجة المخ سبب الحرارة. الخطوة الأكثر أهمية في هذه التجربة الاجتثاث لتحديد مقدار الأمثل لإشعاع الليزر. فشل تشعيع غير كافية لقتل الخلا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومولت هذه الدراسات بالحصول على منح من يأمرون و JSPS كاكينهي منحة أرقام JP25290009، JP25650120، JP17K07494، و JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
Referências
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neurociência. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
- . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
