Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para ablate uma subpopulação geneticamente rotulada de neurônios por um laser de dois fotões de larvas de peixe-zebra.
Abstract
Para identificar o papel de uma subpopulação de neurônios no comportamento, é essencial para testar as consequências do bloqueio de sua atividade em animais vivos. Remoção a laser de neurônios é um método eficaz para essa finalidade quando os neurônios são etiquetados seletivamente com sondas fluorescentes. No presente estudo, são descritos os protocolos para laser retirando uma subpopulação de neurônios usando um microscópio de dois fotões e testes de suas consequências funcionais e comportamentais. Neste estudo, o comportamento de captura de presas em larvas de zebrafish é usado como um modelo de estudo. O circuito pretecto-hipotalâmico é conhecido por fundamentam esta presa visualmente orientado, captura o comportamento. Zebrafish pretectum foram retirado de laser, e atividade neuronal no lobo inferior do hipotálamo (ilha; o alvo da projeção pretectal) foi examinada. Comportamento de captura de presas após ablação pretectal também foi testado.
Introduction
Para entender como o comportamento surge da atividade neuronal no cérebro, é necessário identificar os circuitos neurais envolvidos na geração desse comportamento. Na fase larval, o zebrafish fornece um modelo animal ideal para estudar a função do cérebro associada com o comportamento porque seus cérebros pequenos, transparentes tornam possível investigar a atividade neuronal em uma resolução de celular em uma ampla área da cérebro enquanto observa o comportamento1. Imagem de atividade neuronal em neurônios específicos tornou-se possível graças a invenção dos indicadores geneticamente codificado cálcio (Ca) (GECIs), tais como GCaMP2. GCaMP zebrafish transgênico tem provado para ser útil para associar o circuito neural funcional com comportamento através da realização de imagem Ca em comportar-se de animais3.
Enquanto a imagem de Ca pode demonstrar correlações entre a atividade neuronal e comportamento, para mostrar a causalidade, supressão da atividade neuronal e testar sua consequence(s) sobre o comportamento são passos importantes. Existem várias maneiras de conseguir isso: uso de mutação genética que altera os circuitos neurais específicos4, expressão de neurotoxinas em neurônios específicos5,6, uso de ferramentas de optogenetic como halorhodopsin7, e do laser ablação de neurônios alvo8,9. Ablação a laser é particularmente adequada para eliminar a atividade em um número relativamente pequeno de neurônios específicos. Facilita a eliminação irreversível da atividade neuronal, matando os neurônios avaliar consequências comportamentais.
Um comportamento interessante que pode ser observado na fase larval no zebrafish é a captura de presas (Figura 1A). Esse comportamento visualmente guiadas, objetivo-dirigido fornece um sistema experimental favorável para o estudo da acuidade visual10, transformação visuomotoras11,12,13, percepção visual e reconhecimento de objetos14,15,16,17,18e tomada de decisão19. Como presa é reconhecida por predadores e como a deteção da rapina leva a presa captura o comportamento tem sido uma questão central na neuroetologia20. Neste artigo, enfocamos o papel do circuito pretecto-hipotalâmico formado por projeções de um núcleo no pretectum (núcleo pretectalis superficial pars magnocellularis, daqui por diante, conhecido simplesmente como o pretectum) para a ilha. Ablação a laser do pretectum foi mostrado para reduzir a atividade de captura de presas e abolir a atividade neuronal na ilha que está associada com o de percepção visual presa21. Aqui, os protocolos para a realização de laser ablação e teste seu efeito usando imagens de Ca2 + e gravação comportamental no zebrafish larvas são descritas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora os dois fotões do laser tem uma excelente resolução espacial para ablate especificamente neurônios individuais, cautela deve ser tomada para evitar danos indesejáveis no tecido do cérebro devido ao calor. O passo mais importante no experimento de ablação é determinar a quantidade ideal de irradiação do laser. Irradiação de insuficiente não consegue matar os neurônios. Muita irradiação será calor-danos no tecido circundante, o que irá resultar em efeitos indesejáveis. A gama óptima de irradiaç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estes estudos foram financiados por subvenções recebidas do MEXT, JSPS KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
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