Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine genetisch beschrifteten Subpopulation von Neuronen durch einen zwei-Photonen-Laser von Zebrafisch-Larven abtragen.
Abstract
Um die Rolle einer Subpopulation von Neuronen im Verhalten zu erkennen, ist es wichtig, die Folgen der Blockierung der Aktivität in lebenden Tieren zu testen. Laser-Ablation von Neuronen ist eine wirksame Methode für diesen Zweck, wenn Neuronen mit fluoreszierenden Sonden selektiv beschriftet sind. In der vorliegenden Studie werden Protokolle für Laser Abtrag einer Subpopulation von Neuronen mit ein zwei-Photonen-Mikroskop und Testen ihrer funktionalen und Verhaltensstörungen Folgen beschrieben. In dieser Studie wird Beute Erfassung Verhalten im zebrafischlarven als ein Studienmodell verwendet. Die Pretecto-Hypothalamus Schaltung ist bekannt, dieses optisch getriebene Beute fangen Verhalten zugrunde liegen. Zebrafisch pretetto wurden Laser abgetragen und neuronaler Aktivität in der minderwertigen Lappen des Hypothalamus (ILH; das Ziel der pretectal Projektion) wurde untersucht. Beute Erfassung Verhalten nach pretectal Ablation wurde ebenfalls getestet.
Introduction
Um zu verstehen wie Verhalten von neuronaler Aktivität im Gehirn entsteht, ist es notwendig, die neuronalen Schaltkreise zu identifizieren, die bei der Erzeugung von diesem Verhalten beteiligt sind. Das Larvenstadium der Zebrabärbling bietet ideale Tiermodell für die Funktion des Gehirns zu studieren mit dem Verhalten verbunden, weil ihre kleine, durchsichtige Gehirne neuronalen Aktivität mit einer zellulären Auflösung in einem breiten Bereich der untersuchen ermöglichen die Gehirn beobachtend Verhalten1. Bildgebung neuronaler Aktivität in bestimmten Nervenzellen ist möglich durch die Erfindung der genetisch codierten Kalzium (Ca) Indikatoren (GECIs) wie GCaMP2geworden. GCaMP transgenen Zebrafisch haben sich als nützlich für Verhalten durch die Durchführung von Ca Bildgebung im Verhalten der Tiere3neuronale funktionskreis zuordnen.
Während Ca Bildgebung Korrelationen zwischen neuronaler Aktivität und Verhalten nachweisen kann, um zu zeigen, Kausalität, Unterdrückung der neuronalen Aktivität und testen ihre Consequence(s) auf das Verhalten sind wichtige Schritte. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, dies zu erreichen: Nutzen der genetischen Mutation, die bestimmte neuronale Schaltkreise4, Ausdruck von Neurotoxinen in spezifischen Neuronen5,6, Verwendung von optogenetische Tools wie Halorhodopsin7, verändert und Laser-Ablation von gezielten Neuronen8,9. Laser-Ablation ist besonders geeignet für die Beseitigung der Aktivität in eine relativ kleine Anzahl von spezifischen Neuronen. Irreversiblen Beseitigung von neuronaler Aktivität durch das Töten von Neuronen erleichtert die Beurteilung Verhaltensstörungen folgen.
Ein interessantes Verhalten, das auf das Larvenstadium im Zebrafisch beobachtet werden können ist Beutefang (Abb. 1A). Dieses optisch geführte, zielgerichtetes Verhalten bietet eine günstige Experimentiersystem für die Untersuchung der Sehschärfe10, antwortauslösung Transformation11,12,13, visuelle Wahrnehmung und Anerkennung von Objekte14,15,16,17,18, und Entscheidungsfindung19. Wie wird Beute erkannt durch Raubtiere und wie Beute Erkennung führt um zu Beute fangen Verhalten wurde eine zentrale Frage in Neuroethologie20. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Rolle der Pretecto Hypothalamus Schaltung von Projektionen aus einem Kern in der pretetto gebildet (Nucleus Pretectalis Superficialis pars Magnocellularis, im folgenden einfach als die pretetto gemerkt), die ILH. Laser-Ablation von der pretetto zeigte sich Beute erfassen Aktivität reduzieren und neuronalen Aktivität in der ILH, die mit der Beute visuelle Wahrnehmung21ist, abzuschaffen. Hier, laser Protokolle für die Durchführung von-Ablation und testen seine Wirkung mit Ca2 + Bildgebung und Verhaltensstörungen Aufnahme im Zebrafisch, die Larven beschrieben werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl der zwei-Photonen-Laser eine hervorragende räumliche Auflösung hat, speziell Abtragen einzelne Neuronen, sollte große Vorsicht genommen werden, um unerwünschte Beschädigungen auf das Hirngewebe durch Hitze zu vermeiden. Der wichtigste Schritt bei der Ablation Experiment soll die optimale Höhe der Laserbestrahlung bestimmen. Unzureichende Bestrahlung schlägt fehl, die Neuronen zu töten. Zu viel Bestrahlung Hitzeschäden wird das umliegende Gewebe, was zu unerwünschten Effekten führt. Optimale Bereich der …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studien wurden durch Zuschüsse vom MEXT, JSPS KAKENHI Zuschuss Zahlen JP25290009, JP25650120, JP17K07494 und JP17H05984 finanziert.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
Referências
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