Аблация нейрональных населения с помощью двух Фотон лазера и его оценки с использованием изображений кальция и поведенческих запись в Zebrafish личинки
Summary
Здесь мы представляем протокол к удалять генетически помечены субпопуляция нейронов лазером двух фотонов от данио рерио личинки.
Abstract
Чтобы определить роль субпопуляции нейронов в поведении, важно проверить последствия блокирования свою деятельность на живых животных. Лазерная абляция нейронов является эффективным методом для этой цели, когда нейроны выборочно помечены флуоресцентных зондов. В настоящем исследовании протоколы для лазерной абляции субпопуляции нейронов под микроскопом двух фотонов и тестирования его функциональные и поведенческие последствия описаны. В этом исследовании поведение захвата добычи в zebrafish личинки используется как модель исследования. Pretecto гипоталамический цепи известно, лежат в основе этой визуально инициативе добычу поведение ловля. Данио рерио метаталамус были удаленной лазера, и активность нейронов в нижней доле гипоталамуса (ILH; целевой pretectal проекции) был рассмотрен. Также был испытан поведение захвата добычу после pretectal абляции.
Introduction
Чтобы понять, как поведение возникает от активности нейронов в головном мозге, необходимо определить нейронных цепей, которые участвуют в генерации этого поведения. В личиночной стадии, данио рерио обеспечивает идеальная модель животных для изучения функции мозга связанные с поведением, потому что их небольшой, прозрачной мозги позволяют исследовать нейронной активности в клеточном резолюции в широкой области мозг при соблюдении поведения1. Визуализация активности нейронов в конкретных нейронах стало возможным благодаря изобретение показателей (GECIs) генетически закодированный кальция (Ca), например GCaMP2. GCaMP трансгенных данио рерио оказались полезными для сопоставления функциональных нейронные цепи с поведением путем проведения Ca изображений в себя животных3.
В то время как Ca изображений можно продемонстрировать корреляции между нейронной активности и поведение, чтобы показать причинности, подавление активности нейронов и тестирования его consequence(s) на поведение являются важными шагами. Существуют различные способы для достижения этой цели: использование генетической мутации, которая изменяет конкретные нейронных цепей4, выражение нейротоксинов в конкретных нейронах5,6, использования optogenetic инструментов, таких как галородопсин7, и Лазерная абляция целевых нейронов8,9. Лазерная абляция особенно подходит для ликвидации деятельность в сравнительно небольшое число конкретных нейронов. Необратимой ликвидации нейронной активности, убивая нейронов облегчает оценки поведенческих последствий.
Один из интересных поведение, которое можно наблюдать в личиночной стадии в данио рерио — добычу захвата (рис. 1A). Это визуально гидом, целенаправленное поведение обеспечивает благоприятный экспериментальная система для изучения остроты10, зрительномоторной преобразование11,12,13, визуальное восприятие и признание объекты14,,1516,17,18и принятия решений19. Как хищные признается хищников и как добычу обнаружения ведет добычу ловить поведение был центральным вопросом в Нейроэтология20. В этой статье, мы сосредоточить внимание на роли pretecto гипоталамический контура, образованного прогнозы ядра в метаталамус (ядро pretectalis superficialis Парс magnocellularis, далее, просто к сведению как метаталамус) в ILH. Лазерная абляция метаталамус было показано сократить добычу захвата активности и упразднить нейронной активности в ILH, который связан с добычей визуального восприятия21. Здесь протоколы для выполнения лазерной абляции и тестирования его эффект с помощью Ca2 + изображений и поведенческих запись в данио рерио, личинки описаны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя два фотона лазерного имеет отличное пространственное разрешение для специально удалять отдельных нейронов, большой осторожностью следует во избежание нежелательных повреждений на ткани мозга из-за тепла. Наиболее важным шагом в эксперименте уноса необходимо определить оптимал…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эти исследования финансировались грантов, полученных от МПКСНТ, JSP-страницы KAKENHI Грант номера JP25290009, JP25650120, JP17K07494 и JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
Referências
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neurociência. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
- . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
