Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

Disfunção do sistema de dopamina striatal está envolvida na progressão dos sintomas clínicos observados em várias doenças neurocognitivos. Receptores de dopamina D1 estão presentes no córtex pré-frontal (PFC) e regiões striatal do cérebro e fortemente influenciam processos cognitivos¹, incluindo o trabalho de memória, processamento temporal e comportamento locomotiva^{2,3 , 4 , 5 , 6 , 7}. estudos anterior elucidado que alterações de receptores de dopamina D1 foram associadas com a progressão da atenção défice-Hiperatividade Transtorno (TDAH)⁸, os sintomas neurocognitivos em esquizofrenia^{9, 10} e stress susceptibilidade¹¹. Especificamente, na esquizofrenia, estudos de tomografia por emissão de pósitrons (PET) indicaram que a capacidade de ligação dos receptores de dopamina D1 nos córtices pré-frontal foi altamente relacionada com déficits cognitivos e a presença de sintomas negativos¹¹. O crescimento dendrítica de neurônios excitatórios no córtex pré-frontal, regulado pelo receptor de dopamina D1 alivia o stress susceptibilidade. Além disso, o nocaute do receptor D1 em neurônios corticais pré-frontal medial (mPFC) poderá reforçar a derrota social induzida por estresse evitação social¹².

Aqui, apresentamos uma nova técnica de hibridação in situ RNA Visualizar moléculas de RNA única numa cela com amostras de tecido fresco congelado. A presente técnica tem várias vantagens sobre os métodos que existem dentro da literatura atual. Primeiro, o procedimento atual preserva o contexto espacial e morfológico do tecido e foi realizado em amostras de tecido fresco congelado, para que outros procedimentos que exigem fresco, tecidos não-incorporado podem ser combinados com os métodos atuais. Procedimentos semelhantes em tecidos fixados em formalina e parafina ilustraram que resolução única transcrição pode ser conseguida usando um RNA em situ da hibridação técnica¹³. Detecção de RNA no nível de simples transcrição fornece sensibilidade superior à expressão de número de cópia baixa, bem como a oportunidade de comparar a expressão do gene no nível de células individuais que não podem ser alcançados por outros métodos de detecção do ácido nucleico, tais como técnicas de reação em cadeia (PCR) de polimerase. Além disso, o método atual mantém imagens com uma alta relação sinal-ruído através de sondas de RNA altamente específicas que são hibridizadas de transcritos de RNA único alvo e sequencialmente limite com uma cascata de moléculas de amplificação de sinal na identificação sistema. Finalmente, a tecnologia atual oferece a oportunidade de avaliar vários sistemas biológicos com suas sondas proprietárias de destino específico, ao invés de limitar a nossa investigação a apenas uma classe de marcadores relacionados ao sistema, como a detecção de proteínas por métodos de imuno-histoquímica.

Em nosso estudo, usamos esta novela RNA em situ da hibridação para avaliar a expressão de receptores Drd1α no núcleo accumbens (NAc) e Tirosina Hidroxilase (TH) na substância negra (SNR) de ratos de F344/N tanto masculinos como femininos. A inovador RNA em situ hibridação permitiu-nos investigar mecanismos influenciando DA fixação e DA liberação, simultaneamente, melhorar a nossa compreensão das complexidades do sistema striatal DA. Aqui, descrevemos o procedimento para o cérebro fresco congelado fatias e fornecer métodos de análise de dados para diferentes padrões de coloração: "ponto discreto" ou "clusters".

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade da Carolina do Sul e cuidado Animal (número de garantia federal: A3049-01).

1. preparação das seções do cérebro congelado fresco

1. Usar a cepa de ratos de F344/N: três ratos de cada sexo, 13 meses de idade, peso cerca de 320 g de corpo.
2. Ajuste a concentração de sevoflurano para 5% (overdose de sevoflurano). Continue o sevoflurano exposição após a respiração para por um minuto adicional.
3. Decapitar o rato e remover o cérebro.
4. Submergir o cérebro de rato em nitrogênio líquido por 15 s dentro de 5 min de colheita de tecidos.
5. Equilibrar o cérebro a-20 ° C em um criostato por 1h.
6. 30 µm de seções de corte e transferir para slides (ver Tabela de materiais).
7. Escolha as seções da região núcleo accumbens, aproximadamente 2,76 mm a 2,28 mm anterior Bregma¹⁴.
8. Continuamente uma fatia do cérebro do rato do bulbo olfactório através da região do núcleo accumbens de acordo com a estrutura cerebral estereotáxica do rato.
9. Monte as amostras sobre as guias. Manter as secções a-20 ° C por 10 min secar.
10. Mergulhe imediatamente slides no pre-refrigerados paraformaldeído 4% para 1 h a 4 ° C.
11. Coloque os slides em um gradiente crescente de etanol à temperatura ambiente (RT): 50% EtOH por 5 min; 70% EtOH por 5 min; e 100% EtOH por 5 min.
12. Repetir com fresco 100% EtOH.
13. Coloque slides em papel absorvente e secar ao ar.
14. Desenhar uma barreira em torno de cada seção com uma caneta de barreira (ver Tabela de materiais). Deixa a barreira secar completamente durante 1 min.

2. pré-tratamento de seções do cérebro

1. Ligue o forno e regule a temperatura para 40 ° C.
2. Adicione 3 gotas (90 µ l) de reagente 4 pré-tratamento (ver Tabela de materiais) em cada seção do cérebro (uma seção por slide).
3. Incubar as seções durante 30 min à RT
4. Mergulhe os slides em 1X PBS durante 1 min no RT. Repeat com frescos 1X PBS.
   Nota: Slides não devem ficar em PBS 1x por mais de 15 min.

3. o RNA In Situ da hibridação fluorescente Multiplex ensaio

1. Aquecer a sonda alvo por 10 min a 40 ° C em banho-maria e em seguida, refresque a RT
2. Coloque o reagente de RNA (por exemplo, o Amp FL 1-4) em RT
3. Remover o excesso de líquido das laminas com papel absorvente e coloque de volta na prateleira corrediça (ver Tabela de materiais).
4. Adicione 3 gotas (90 µ l) da sonda Drd1α (C1) sobre a fatia de amostra. Incubar durante 2 h a 40 ° C.
5. Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
6. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
7. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 1-FL sobre a fatia de amostra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
8. Mergulhe slides em tampão de 1 lavagem por 2 min em RT. Repeat com buffer de 1wash fresco.
9. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
10. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 2-FL sobre a fatia de amostra. Incube por 15 min a 40 ° C.
11. Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
12. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
13. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 3-FL sobre a fatia de amostra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
14. Mergulhe os slides em 1x tampão de lavagem por 2 min em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
15. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
16. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 4-FL-Alt A sobre a fatia de amostra. Incube por 15 min a 40 ° C.
17. Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
18. Remover o excesso de líquido de slides e imediatamente coloque 2 gotas de reagente de montagem (ver Tabela de materiais) para cada seção.
19. Coloque uma lamela de 22 mm de 22 mm (ver Tabela de materiais) sobre cada seção do cérebro.
20. Armazenar slides no escuro a 2-8 ° C até secar.
21. Ligue o microscópio confocal e alternar para um objectivo X 60.
22. Obter imagens de Z-pilha com um microscópio confocal. Veja o vídeo suplementar para um procedimento de detalhe da imagem latente confocal.
23. Adquirir imagens de Drd1α rotulado de células na região de núcleo accumbens (excitação: 488 nm; Emissão: 515/30 nm).
    Nota: Não deixe o cérebro seções secam entre as etapas de incubação.

4. análise de dados

1. Semi-quantitativamente analisar o padrão de coloração: "pontos discretos".
   1. Para identificar a célula individual da imagem, realize DAPI coloração como um marcador nuclear. No entanto, é ainda difícil de analisar determinadas partes do tecido cerebral, uma vez que tem vários tipos de células com forma irregular de núcleos e/ou células. Aqui, dois pesquisadores experientes atribuir separadamente cada célula de imagens para definir a região da célula.
   2. Visualmente, marca cada célula dentro as imagens confocal representativas baseado no número de pontos por célula, usando os critérios específicos (figura 1B).
   3. Determinar o número total de células em cada categoria e dividir pelo número total de células x100 para criar gráficos de frequência relativa que exibem a frequência percentual de células dentro de cada categoria para todas as seções do tecido (Figura 2A) e para os machos e fêmeas separadamente (Figura 2E).
   4. A soma das células dentro de todas as categorias anteriores, dividir pelo número total de células x100 para determinar a frequência cumulativa das células para todas as seções do tecido (Figura 2B) e para os machos e fêmeas separadamente (Figura 2F).
2. Analise estatisticamente os "pontos discretos" coloração padrão (opcional).
   1. Examinar o número de pontos por celular para fornecer uma variável categórica ordinal na natureza (ou seja, o número de células que caem em cada categoria de classificação da menor expressão celular (1), a mais alta expressão da célula (9)) para mais análises estatísticas.
   2. Após análise das estatísticas descritivas, use três abordagens principais: uma estatística de Mantel-Haenszel, um teste de Mann-Whitney U e um teste de Kruskal-Wallis. Embora a abordagem estatística exata será dependente a questão experimental de design e pesquisa de interesse, uma árvore de decisão estatística (Figura 4) pode ajudar na tomada de decisões em relação a abordagem analítica.
3. Quantificar a intensidade de sinal na região de interesse (ROI) para coloração padrão: "clusters".
   1. Calcule a intensidade do sinal de cada imagem usando a seguinte equação:
      Intensidade do sinal = intensidade Total de imagem ROI - (fundo de média intensidade × imagem Total área)
   2. Conte o número total de células dentro de imagem ROI para calcular a expressão aproximada de sinal por célula. Grupo as diferenças na intensidade de sinal/imagem, bem como o número de células/imagem podem ser de interesse para considerar os mecanismos que podem contribuir para diferenças de grupo vistas na expressão de sinal/célula (Figura 3B-3D).
4. Analise estatisticamente os "clusters" coloração padrão (opcional).
   1. Examine a expressão do sinal/celular para fornecer uma variável contínua para posterior análise estatística. Uso de duas abordagens, incluindo um teste t de amostras independentes e análise de variância (ANOVA), com base no número de fatores between-temas incluídas no projeto. Uma árvore de decisão estatística (Figura 4) pode ajudar na tomada de decisões em relação a abordagem estatística mais adequada.

O atual estudo observou um "pontos discretos" padrão para a expressão de RNA nos receptores de dopamina D1-alfa (Drd1α) de coloração do CCN em ratos F344/N (figura 1A). Sinais de fluorescência individuais foram identificados facilmente e podem ser vistos como único "pontos", cada um deles representa um único transcrito de RNA dentro da célula. Para imagens de NAc que exibem os "pontos discretos" padrão de coloração, avaliamos a gama dinâmica de expressão usando uma análise semi-quantitativa (figura 1A, Figura 2Ae 2B). Cada célula foi marcada "0-9", baseado no número de pontos por celular. Este "sinal hibridizada"-Pontuação (H-partitura) método, portanto, pode avaliar a amplitude e a variabilidade de expressão Drd1α na células individuais.

A abordagem semi-quantitativa para o "ponto discreto" coloração padrão fornece uma variável categórica ordinal na natureza (ou seja, o número de pontos por celular classificados do menor (1) a mais alta (9)) para posterior análise estatística. No presente estudo, estávamos interessados em examinar o efeito de um fator entre sujeitos (ou seja, sexo) na expressão de Drd1α no NAc. Para explicar a estrutura de dados aninhadas (ou seja, duas imagens de Z-pilha de Drd1α rotulado células no NAc foram obtidas para cada animal), contagem média valores foram calculados para cada categoria e análise estatística (masculino: n= 3, fêmea: n = 3). Dado o nosso interesse em examinar as diferenças em um fator entre sujeitos (ou seja, sexo) com dois grupos (ou seja, macho, fêmea) um U Mann-Whitney teste foi realizado para avaliar as diferenças na contagem de células mediano (Figura 2D). Um teste de Mann-Whitney U revelou um significativo efeito principal do sexo [z=-5.8, p≤0.001], com fêmeas exibindo uma pontuação de diminuição da célula mediana em relação a animais machos. Figura 2E e 2F ilustram a frequência das células em cada categoria usando dois métodos: frequência relativa e a frequência cumulativa. Animais fêmeas exibido uma mudança significativa na distribuição, com uma maior frequência de células nas categorias ordenadas inferiores em relação a animais machos. Realizou-se um teste de Mantel-Haenszel de associação para analisar estatisticamente a distribuição, revelando um efeito significativo do sexo [χ²_MH(1) = 67,3, p≤0.001]. Assim, em geral, os resultados sugerem diferenças de sexo claro na expressão de Drd1α no NAc.

Em casos onde o número de cópia da transcrição é muito alto, os sinais podem aparecer como clusters. Aqui, a expressão de tirosina hidroxilase (TH) na região SNR mostrou os "clusters" coloração padrão (Figura 3A). Para quantificar este marcador de alta-expressando, nós primeiro em média, a intensidade de fundo de oito áreas de plano de fundo diferente. Depois de definir o limiar de intensidade mínimo acima a intensidade média de plano de fundo, a intensidade da imagem ajustada foi analisada como sinal por célula de th

Dado o nosso interesse em examinar um fator entre sujeitos (ou seja, sexo), um t-teste de amostras independentes é uma abordagem estatística adequada. Para a análise, dados foram log-transformadas. Para explicar a estrutura de dados aninhadas (ou seja, duas imagens de Z-pilha de TH rotulado células no SNR foram obtidas para cada animal), valores médios foram calculados e usados para a análise estatística (masculino: n= 2, fêmea: n= 3). Animais fêmeas exibido um aumento significativo na intensidade de sinal médio (Figura 3B), sugestiva de um maior nível de expressão total do TH, em relação a animais machos (t(3) = 3.3, p≤0.05). No entanto, não sexo significativas foram observadas diferenças em ambos o número de células por imagem (t(3) = 2.0, p> 0,05; A Figura 3) ou a média do sinal expressão por célula (t(3) = 2.0, p> 0,05; Figura 3D). Uma ANOVA mista-projeto, considerando as três medidas como um fator dentro-sujeito, também revelou um efeito significativo principal do sexo [F (1,3) = 10.6, p≤0.05].

Figura 1: critérios de análise semi-quantitativa no número médio de pontos por celular para coloração padrão: "pontos discretos". R. imagens confocal representante (60 X) de expressão Drd1α em diferentes pontuações (amplificado escala de 250% em relação ao tamanho original da imagem) B. A categoria "pontuação" específicos para cada critério. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: nível de dopamina D1-alfa receptor (Drd1α) do RNA no núcleo Accumbens região de ratos de F344/N. R. O % da frequência relativa de cada categoria "pontuação". B. uma curva sigmoidal dose-resposta fornecido um ajuste bem descrito (r²= 0,99) com intervalos de confiança de 95% (CI; indicado pelas linhas pontilhadas) estava apto para o % de frequência cumulativa de cada categoria "pontuação". C. confocal imagens representativas (60 X) de expressão Drd1α em ratos machos e fêmeas, que têm os "pontos discretos" padrão de coloração. D. Gráfico representativo da pontuação média célula em ratos machos e fêmeas. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). E. O % da frequência relativa de cada categoria "pontuação", comparando a expressão em tecidos de ratos machos e fêmeas. F. curvas dose-resposta Sigmoidal fornecido um ajuste bem descrito (r²s = 0,99) com intervalos de confiança de 95% para a % de frequência cumulativa de cada categoria "pontuação" entre ratos machos e fêmeas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: nível de tirosina hidroxilase RNA (TH) na região de Substantia Nigra (SNR) em ratos F344/N. R. imagens confocal representante (60 X; Excitação: 543 nm; Emissão: 590/50 nm) de expressão TH em ratos machos e fêmeas, que têm os "clusters" padrão de coloração. B-D. Análise representativo da intensidade de sinal por célula. Expressão de sinal / célula pode ser derivada de quantificar a intensidade do sinal da imagem (com intensidade limiar definido acima de fundo) e dividindo pelo número de células dentro da imagem. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: árvore de decisão para a análise estatística recomendada. A árvore de decisão fornece diretrizes para determinar qual análise estatística é mais apropriado para a pergunta de pesquisa de interesse. A árvore de decisão não é exaustiva e em alguns casos, outras análises podem ser apropriados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste protocolo, descrevemos uma nova técnica de hibridação in situ por fatias de cérebro fresco congelado avaliar a expressão de receptores Drd1α no núcleo accumbens (NAc) e Tirosina Hidroxilase (TH) na região de substantia nigra (SNR). Nós também fornecemos métodos de análise de dados para diferentes padrões de coloração: "ponto discreto" ou "clusters".

Os passos críticos para um ensaio de sucesso fluorescência multiplex do RNA em situ da hibridação são incluídos. Uma vez que decapitar o rato e remover o cérebro, congelar o cérebro em nitrogênio líquido dentro de 5 min. manter as seções do cérebro a-20 º C até fixação de paraformaldeído 4%. Após o 30 min de incubação do pré-tratamento 4, slides não devem ficar em PBS 1x por mais de 15 min. Não deixe o cérebro seções secam entre as etapas de amplificação. Imagem latente confocal é muito útil para fornecer imagens de alta qualidade apresentando sinais claros de coloração em amostra de tecido. Usar o forno de hibridização rapidamente e eficientemente trará as amostras a 40 ° C.

Os sinais de fluorescência individual da expressão do receptor de Drd1α no NAc foram identificados como único "pontos," cada um deles representa um único transcrito de RNA dentro da célula. Importante, o tamanho do "ponto" reflete diferenças nas condições de ensaio, preparação da amostra e outros fatores ao invés de níveis de expressão de RNA-Drd1α. Da mesma forma, a intensidade do sinal de "pontos" individuais não é relevante para os níveis de expressão de RNA-Drd1α. Avaliamos a gama dinâmica dessa expressão como uma análise semi-quantitativa marcada com "0-9", baseado no número de pontos por célula, que pode avaliar a amplitude e a variabilidade de expressão Drd1α. Além disso, o exame do número de pontos por célula fornece uma variável categórica para mais análises estatísticas.

Após o exame da estatística descritiva, nosso protocolo recomenda três principais abordagens para analisar estatisticamente os sinais que apresentam o "dot discreto" coloração padrão, que fornece uma variável ordinal para posterior análise. Especificamente, recomenda-se um teste não paramétrico de Mann-Whitney U, um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e um teste de Mantel-Haenszel de associação. Um teste de Mann-Whitney U e um teste de Kruskal-Wallis são mais apropriadas quando examinar apenas um entre-temas fator (por exemplo, sexo). Além disso, um teste de Mantel-Haenszel de associação pode ser apropriado para examinar as mudanças na distribuição. Análises estatísticas mais complexas, incluindo uma equação estimando generalizada ou modelo misto linear geral pode ser apropriado quando fatores adicionais estão incluídos. As recomendações não são exaustivas, e a abordagem estatística exata será dependente do delineamento experimental e pergunta de pesquisa de interesse.

No entanto, em casos onde o número de cópia da transcrição é muito alto, os sinais podem aparecer como clusters. Aqui, expressão de TH na região SNR mostrou os "clusters" padrão de coloração. Para quantificar o marcador TH alta-expressando, ajustamos a intensidade da imagem com base na configuração do limiar de intensidade mínima acima a intensidade média de fundo e analisados como sinal por célula de th Sinais que apresentam o "cluster" coloração padrão, tais como o TH no SNR, podem ser analisados estatisticamente usando um independente amostras testes t ou ANOVA para comparar os grupos.

Existem limitações deste romance RNA em situ da hibridação do ensaio. Para o "discreto dot" padrão de coloração, estes incluem como definir uma célula individual com mais precisão. Em nosso estudo, para identificar a célula individual na imagem, realizamos DAPI coloração como um marcador nuclear. No entanto, é ainda difícil de analisar certas partes do tecido cerebral, uma vez que tem vários tipos de células com formas irregulares de núcleos e/ou células. Aqui, dois pesquisadores experientes atribuir separadamente cada célula de imagens para definir a região da célula. Para os "clusters" padrão de coloração, software específico deve ser escolhido a configuração do limiar ou recognization célula automática.

Assim, o inovador RNA em situ da hibridação ensaio permitiu-nos investigar mecanismos influenciando DA fixação e DA liberação, simultaneamente, melhorar a compreensão das complexidades do sistema striatal DA. Em geral, pesquisadores beneficiaria a novela RNA em situ da hibridação técnica quando investigando alterações disfuncionais dopaminergic marcadores durante o surgimento e a progressão de distúrbios cerebrais.