Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.
In das zentrale Nervensystem ist der D1-Alpha-Rezeptor Subtyp (Drd1α) die am häufigsten vorkommende Dopamin (DA)-Rezeptor, der spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der neuronale Wachstum und Entwicklung. Die Mechanismen, die Drd1α Rezeptor Anomalien Vermittlung Verhaltensreaktionen und modulierende Working Memory-Funktion sind jedoch noch unklar. Mit einem neuartigen RNA in Situ Hybridisierung Assay, identifiziert die aktuelle Studie Drd1α Dopamin Rezeptor und Tyrosin Hydroxylase (TH) RNA Ausdruck von DA-bezogene Schaltungen in den Nucleus Accumbens (NAc) Bereich und Substantia Nigra Region (SNR), bzw.. Drd1α Ausdruck in der NAc zeigt einen “diskrete Dot” Färbung Muster. Deutliche Geschlechtsunterschiede in Drd1α Ausdruck wurden beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigt TH ein “gruppierte” Färbung Muster. Zu TH Ausdruck angezeigt weibliche Ratten einen höheren Signal Ausdruck pro Zelle im Vergleich zu männlichen Tieren. Die hier vorgestellten Methoden bieten eine neuartige in Situ Hybridisierung Technik für die Untersuchung von Veränderungen der Dopamin-System Funktionsstörung während das Fortschreiten der Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
Dysfunktion des striatalen Dopamin-Systems beteiligt sich das Fortschreiten der klinischen Symptome bei mehreren neurokognitiven Krankheiten beobachtet. Dopamin-D1-Rezeptoren sind in den präfrontalen Kortex (PFC) und striatalen Regionen des Gehirns und stark beeinflussen kognitive Prozesse1, einschließlich der Verwendung von Speicher, zeitliche Verarbeitung und Lokomotive Verhalten2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. frühere Studien aufgeklärt, dass Änderungen der Dopaminrezeptoren D1 verbunden mit dem Fortschreiten der Aufmerksamkeit Defizit-Hyperaktivität-Störung (ADHS)8, die neurokognitiven Symptome bei Schizophrenie9, waren 10 und Stress Anfälligkeit11. Insbesondere bei Schizophrenie zufolge Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Studien die Bindungsfähigkeit der Dopamin-D1-Rezeptoren in den präfrontalen Cortex hoch mit kognitiven Defiziten und die Anwesenheit von negativen Symptomen11zusammenhing. Das dendritische Wachstum der exzitatorischen Neuronen im präfrontalen Cortex von Dopamin D1-Rezeptor reguliert lindert Stressempfindlichkeit. Darüber hinaus könnte die Knockdown von D1-Rezeptor im medialen präfrontalen kortikalen (mPFC) Neuronen soziale Niederlage Stress-induzierte soziale Vermeidung12verbessern.
Hier stellen wir eine neuartige Technik der RNA in Situ Hybridisierung, einzelnen RNA-Moleküle in einer Zelle mit Tiefkühlfrische Gewebeproben zu visualisieren. Das vorliegende Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber Methoden, die in der aktuellen Literatur vorhanden sind. Zuerst die aktuelle Prozedur bewahrt den räumlichen und morphologischen Kontext des Gewebes und wurde am Tiefkühlfrische Gewebeproben durchgeführt, so dass andere Verfahren, die frische, nicht eingebettete Gewebe mit den aktuellen Methoden kombiniert werden können. Ähnliche Verfahren in Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Gewebe haben gezeigt, dass einzelne Transkription Auflösung mit einer RNA in Situ Hybridisierung Technik13erreicht werden kann. Erkennung von RNA Ebene der einzelnen Transkription bietet höhere Sensitivität zu niedrigen Kopie Zahlenausdruck sowie die Möglichkeit, Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen vergleichen, die von anderen Nukleinsäure-Nachweismethoden nicht erreicht werden kann, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Techniken. Darüber hinaus unterhält die aktuelle Methode Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis durch hochspezifische RNA-Sonden, die hybridisiert, einzelnes Ziel-RNA-Transkripte und nacheinander gebunden mit einer Kaskade von Signalmolekülen Verstärkung bei der Erkennung System. Zu guter Letzt bietet die gegenwärtige Technologie die Möglichkeit, mehrere biologische Systeme mit der Target-spezifische proprietären Sonden, anstatt unsere Untersuchung auf nur eine Klasse von systembezogenen Markierungen wie Proteindetektion durch Begrenzung zu bewerten immunhistochemische Methoden.
In unserer Studie haben wir diese neuartige RNA in Situ Hybridisierung, um Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) zu bewerten sowohl weibliche als auch männliche F344/N Ratten verwendet. Die innovative RNA in Situ Hybridisierung konnten wir Mechanismen beeinflussen DA Aufnahme und DA Freigabe gleichzeitig, ein besseres Verständnis der Komplexität der striatalen DA System zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Vorgehensweise Tiefkühlfrische Gehirn Scheiben und Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: “diskrete Dot” oder “Cluster”.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige Technik der in Situ Hybridisierung für Tiefkühlfrische Gehirnscheiben, Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) Region zu bewerten. Wir bieten auch Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: “diskrete Dot” oder “Cluster”.
Die entscheidenden Schritte für einen erfolgreichen Multiplex-Fluoreszenz RNA-Assay in Situ Hybri…
The authors have nothing to disclose.
Die vorliegenden Werke wurden von der National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse, HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 unterstützt. Partielle Fonds sorgte ein NIH T32 Ausbildung Stipendium in Biomedical-Behavioral Science.
HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |