कुतर नाभिक के भीतर डोपामाइन D1-अल्फा रिसेप्टर की पहचान सीटू का पता लगाने प्रौद्योगिकी में एक अभिनव आरएनए द्वारा Accumbens
Summary
नाभिकीय accumbens में डोपामाइन d1-अल्फा रिसेप्टर की पहचान एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोग के दौरान D1 रिसेप्टर रोग स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में एकल आरएनए अणुओं कल्पना करने के लिए सीटू संकरण परख में एक उपंयास आरएनए प्रदर्शन किया ।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, D1-अल्फा उप प्रकार रिसेप्टर (Drd1α) सबसे प्रचुर मात्रा में डोपामाइन (डीए) रिसेप्टर, जो न्यूरॉन विकास और विकास को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हालांकि, व्यवहार प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता Drd1α रिसेप्टर असामान्यताओं अंतर्निहित तंत्र और काम कर स्मृति समारोह नियमन अभी भी अस्पष्ट हैं. सीटू संकरण परख में एक उपंयास आरएनए का प्रयोग, वर्तमान अध्ययन की पहचान की डोपामाइन Drd1α रिसेप्टर और tyrosine hydroxylase (गु) दा से आरएनए अभिव्यक्ति नाभिक accumbens (एनएसी) क्षेत्र और substantia नाइग्रा क्षेत्र (SNR) में सर्किट से संबंधित है, क्रमशः. एनएसी में Drd1α अभिव्यक्ति एक “असतत डॉट” धुंधला पैटर्न से पता चलता है । स्पष्ट सेक्स Drd1α अभिव्यक्ति में अंतर मनाया गया । इसके विपरीत, वें एक “संकुल” धुंधला पैटर्न से पता चलता है । गु अभिव्यक्ति के बारे में, मादा चूहों सेल प्रति पुरुष जानवरों के सापेक्ष एक उच्च संकेत अभिव्यक्ति प्रदर्शित । यहां प्रस्तुत तरीकों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों की प्रगति के दौरान डोपामाइन प्रणाली में शिथिलता में परिवर्तन की जांच के लिए सीटू संकरण तकनीक में एक उपंयास प्रदान करते हैं ।
Introduction
striatal डोपामाइन प्रणाली की शिथिलता कई neurocognitive रोगों में मनाया नैदानिक लक्षणों की प्रगति में शामिल है । डोपामाइन D1 रिसेप्टर्स सामने प्रांतस्था में मौजूद हैं (पीएफसी) और मस्तिष्क के striatal क्षेत्रों और भारी संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं को प्रभावित1, काम स्मृति सहित, लौकिक प्रसंस्करण, और लोकोमोटिव व्यवहार2,3 , 4 , 5 , ६ , 7. पिछला अध्ययन आविर्भाव कि डोपामाइन D1 रिसेप्टर्स के परिवर्तन ध्यान घाटे की प्रगति के साथ जुड़े थे-सक्रियता विकार (एडीएचडी)8, एक प्रकार का पागलपन में neurocognitive लक्षण9, 10 और तनाव झेलते हुए11. विशेष रूप से, एक प्रकार का पागलपन में, पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) अध्ययनों से संकेत दिया कि आकडे cortices में डोपामाइन D1 रिसेप्टर्स के बंधन की क्षमता अत्यधिक संज्ञानात्मक घाटे और नकारात्मक लक्षण की उपस्थिति के लिए संबंधित था11. उत्तेजक न्यूरॉन्स की वृक्ष विकास में डोपामाइन D1 रिसेप्टर द्वारा विनियमित आकडे प्रांतस्था तनाव संवेदनशीलता को दूर करता है. इसके अलावा, औसत दर्जे का cortical में D1 रिसेप्टर के पछाड़ना (मध् य) ंयूरॉंस सामाजिक हार तनाव-प्रेरित सामाजिक परिहार 12 बढ़ा सकता है ।
यहां, हम सीटू संकरण में आरएनए के एक उपंयास तकनीक का परिचय ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों के साथ एक सेल में एकल आरएनए अणुओं कल्पना । वर्तमान तकनीक के तरीकों पर कई लाभ है कि मौजूदा साहित्य के भीतर मौजूद है । सबसे पहले, वर्तमान प्रक्रिया ऊतक के स्थानिक और रूपात्मक संदर्भ को बरकरार रखता है और ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों पर किया गया था ताकि अन्य प्रक्रियाओं ताजा, गैर-एम्बेडेड ऊतकों वर्तमान विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है की आवश्यकता होती है । formalin में इसी तरह की प्रक्रियाओं-फिक्स्ड और आयल-एंबेडेड ऊतकों सचित्र है कि एक प्रतिलेखन संकल्प सीटू संकरण तकनीक13 में एक आरएनए का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । एकल प्रतिलेखन स्तर पर आरएनए का पता लगाने के लिए कम कॉपी संख्या अभिव्यक्ति के लिए बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता है और साथ ही अन्य न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के तरीकों से प्राप्त नहीं किया जा सकता है कि व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने का अवसर, जैसे पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) तकनीक । इसके अतिरिक्त, वर्तमान विधि एकल लक्ष्य आरएनए टेप करने के लिए संकर कर रहे हैं कि अत्यधिक विशिष्ट आरएनए जांच के माध्यम से एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ छवियों को बनाए रखता है, और पता लगाने में संकेत प्रवर्धन अणुओं की एक झरना के साथ क्रमिक रूप से बाध्य सिस्टम. अंत में, वर्तमान प्रौद्योगिकी के लिए अपने लक्ष्य विशेष स्वामित्व जांच के साथ कई जैविक प्रणालियों का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान करता है, बल्कि प्रणाली के केवल एक वर्ग के लिए हमारी जांच सीमित से संबंधित मार्करों जैसे प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा immunohistochemistry तरीके ।
हमारे अध्ययन में, हमने सीटू संकरण में इस उपन्यास आरएनए का उपयोग नाभिकीय accumbens (एनएसी) में Drd1α रिसेप्टर एक्सप्रेशन का मूल्यांकन करने और नर और मादा hydroxylase दोनों के substantia नाइग्रा (SNR) में tyrosine F344 (गु) अभिव्यक्ति/ सीटू के संकरण में अभिनव आरएनए ने हमें दोनों डीए को प्रभावित करने वाले तंत्र की जांच करने और एक साथ डीए जारी करने, striatal दा सिस्टम की जटिलताओं के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने में सक्षम बनाया । यहां, हम ताजा-जमे हुए मस्तिष्क स्लाइस के लिए प्रक्रिया का वर्णन है और अलग धुंधला पैटर्न के लिए डेटा विश्लेषण के तरीके प्रदान: “असतत डॉट” या “क्लस्टर्स” ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम के एक उपंयास तकनीक का वर्णन ताजा-जमे हुए मस्तिष्क स्लाइस के लिए सीटू संकरण में नाभिक accumbens (एनएसी) और tyrosine hydroxylase (गु) अभिव्यक्ति में substantia नाइग्रा (SNR) क्षेत्र में Drd1α रिसेप्टर अभिव्यक्ति क…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्तमान कार्यों के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) अनुदान HD043680, MH106392, DA013137, और NS100624 द्वारा समर्थित थे । आंशिक निधि जैव चिकित्सा-व्यवहार विज्ञान में NIH T32 प्रशिक्षण अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी ।
Materials
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
Referências
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neurociência. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neurociência. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).
