تحديد مستقبلات الدوبامين D1-ألفا داخل Accumbens نواة القوارض بالحمض النووي الريبي مبتكرة في الموقع تكنولوجيا الكشف عن
Summary
تحديد مستقبلات الدوبامين D1-ألفا في accumbens نواة أمر بالغ الأهمية لتوضيح خلل مستقبلات D1 خلال مرض الجهاز العصبي المركزي. أجرينا الحمض النووي الريبي رواية في الموقع تهجين مقايسة لتصور واحد من جزيئات الحمض النووي الريبي في منطقة محددة من الدماغ.
Abstract
في الجهاز العصبي المركزي، مستقبلات النوع الفرعي D1-ألفا (Drd1α) هي الأكثر وفرة من مستقبلات الدوبامين (DA)، الذي يلعب دوراً حيويا في تنظيم نمو الخلايا العصبية، والتنمية. ومع ذلك، الآليات الكامنة وراء شذوذ مستقبلات Drd1α وساطة الاستجابات السلوكية وتحوير وظيفة الذاكرة العاملة لا تزال غير واضحة. باستخدام الحمض النووي الريبي رواية في الموقع تهجين مقايسة، وحددت الدراسة الحالية التعبير الحمض النووي الريبي hydroxylase (TH) تيروزين ومستقبلات الدوبامين Drd1α من الدوائر ذات الصلة دا في منطقة accumbens (NAc) نواة والمنطقة الرمادية في الدماغ (دائرة الاستخبارات الوطنية)، على التوالي. يظهر التعبير Drd1α في ائتلاف البرنامج الجديد “نقطة منفصلة” تلطيخ النمط. وقد لوحظت الاختلافات بين الجنسين واضحة في التعبير Drd1α. وفي المقابل، يظهر ال نمط المصبوغة “متفاوت المسافات”. فيما يتعلق بالتعبير TH، عرض إناث الفئران تعبير إشارة أعلى كل خلية بالنسبة إلى الحيوانات الذكور. الأساليب المقدمة هنا توفر تقنية تهجين رواية في عين المكان للتحقيق في أحداث تغييرات في خلل نظام الدوبامين خلال تقدم أمراض الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
الخلل في نظام striatal الدوبامين تشترك في تطور الأعراض السريرية التي لوحظت في العديد من الأمراض عصبي. مستقبلات الدوبامين D1 موجودة في قشرة prefrontal (PFC) ومناطق سترياتال في المخ، وتؤثر بشدة على العمليات الإدراكية1، بما في ذلك العمل في الذاكرة وتجهيز الزمانية والسلوك قاطرة2،3 , 4 , 5 , 6 , 7-أوضحت الدراسات السابقة أن التغييرات من مستقبلات الدوبامين D1 ارتبطت بتطور اهتمام العجز-فرط النشاط الفوضى (إعاقة)8، أعراض عصبي في الفصام9، 10 والإجهاد قابلية11. على وجه التحديد، في مرض الفصام، أشارت دراسات التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) إلى أن القدرة الملزمة من مستقبلات الدوبامين D1 في كورتيسيس prefrontal عالية تتصل بالعجز الإدراكي ووجود الأعراض السلبية11. النمو الجذعية ضادات الخلايا العصبية في قشرة prefrontal ينظم مستقبلات الدوبامين D1 يخفف قابلية الإجهاد. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تعزز ضربة قاضية مستقبلات D1 في الخلايا العصبية الآنسي prefrontal القشرية (mPFC) الأبطال الاجتماعية الناجمة عن الإجهاد الهزيمة الاجتماعية12.
هنا، نحن نقدم تقنية جديدة للجيش النيبالي الملكي في الموقع التهجين لتصور واحد من جزيئات الحمض النووي الريبي في زنزانة مع عينات الأنسجة المجمدة الطازجة. هذا الأسلوب مزايا متعددة أكثر من الأساليب التي توجد داخل الأدبيات الراهنة. أولاً، الإجراء الحالي يحافظ على السياق المكاني والخصائص المورفولوجية للأنسجة وأجرى على عينات الأنسجة المجمدة الطازجة حيث أن إجراءات أخرى تتطلب الطازجة، قد يتم دمج الأنسجة غير مضمن مع الأساليب الحالية. إجراءات مماثلة في الأنسجة الثابتة الفورمالين وجزءاً لا يتجزأ من البارافين قد بينت أنه يمكن التوصل إلى حل النسخ واحد استخدام الجيش الملكي النيبالي في الموقع تهجين تقنية13. الكشف عن الحمض النووي الريبي على مستوى النسخ واحد يوفر حساسية فائقة للتعبير رقم نسخة منخفضة، فضلا عن فرصة لمقارنة التعبير الجيني على مستوى الخلايا الفردية التي لا يمكن تحقيقها بطرق الكشف عن الأحماض النووية الأخرى، مثل تقنيات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). بالإضافة إلى ذلك، تحتفظ الطريقة الحالية للصور مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال تحقيقات الجيش الملكي النيبالي محددة للغاية تهجين لنسخ الحمض النووي الريبي هدف واحد، وملزمة بالتتابع بسلسلة من الإشارات التضخيم الجزيئات في الكشف عن النظام. وأخيراً، توفر التكنولوجيا الحالية الفرصة لتقييم النظم البيولوجية متعددة مع بالمسابير الملكية محددة الهدف، بدلاً من الحد من تحقيقاتنا إلى فئة واحدة فقط من علامات المتصلة بالنظام مثل الكشف عن البروتين أساليب إيمونوهيستوتشيميستري.
في دراستنا، استخدمنا هذا الجيش الملكي النيبالي الرواية في الموقع التهجين تقييم التعبير مستقبلات Drd1α في accumbens نواة (NAc) والتعبير تيروزين hydroxylase (ال) في المادة الرمادية (دائرة الاستخبارات الوطنية) لكل من الذكور والإناث من الفئران ن F344/. الجيش الملكي النيبالي مبتكرة في الموقع التهجين مكنتنا من التحقيق آليات التأثير على امتصاص دا والإصدار دا في وقت واحد، وتحسين فهمنا لتعقيدات النظام سترياتال دا. هنا، يمكننا وصف الإجراء للدماغ مجمدة طازجة شرائح وتوفير أساليب تحليل البيانات لمختلف أنماط المصبوغة: “نقطة منفصلة” أو “مجموعات”.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، يمكننا وصف تقنية رواية من التهجين في الموقع لشرائح مجمدة طازجة الدماغ لتقييم التعبير مستقبلات Drd1α في accumbens نواة (NAc) والتعبير تيروزين hydroxylase (ال) في المنطقة الرمادية في الدماغ (دائرة الاستخبارات الوطنية). كما نقوم بتوفير أساليب تحليل البيانات لمختلف أنماط المصبوغة: “?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعمت الأعمال الحالية بالمعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المنح HD043680، MH106392، DA013137، و NS100624. صندوق جزئية قدمت منحة تدريب T32 المعاهد الوطنية للصحة في مجال العلوم الطبية الحيوية-السلوكية.
Materials
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
Referências
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neurociência. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neurociência. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).
