Summary

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

Published: March 27, 2018
doi:

Summary

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA を行った。

Abstract

中枢神経系 D1 α サブタイプ受容体 (Drd1α) は最も豊富なドーパミン (DA) の受容体で、神経の成長・発達の調節に重要な役割を果たしています。しかし、Drd1α 受容体異常行動応答を仲介してワーキング メモリ機能の変調メカニズムはまだ明らかではありません。交配アッセイの in situ新規 RNA を使用すると、現在の研究特定 RNA 発現核側坐 (NAc) エリアに位置し中脳領域 (SNR)、DA 関連回路から受容体とチロシン水酸化酵素 (TH) ドーパミン Drd1αそれぞれ。NAc の Drd1α 式は、「離散ドット」染色パターンを示しています。Drd1α 式で明確な性差が認められました。対照的に、第 5 回は、「クラスター化された」染色パターンを示します。番目の式について雌ラットはオスの動物と相対的にセルごとのより高い信号式を表示されます。紹介した方法は、中枢神経系疾患の進行中にドーパミン システムの機能不全の変化を調査するため小説の in situハイブリダイゼーション手法を提供します。

Introduction

線条体ドーパミン系機能障害は複数の神経認知症にみられる臨床症状の進行に関与しています。ドーパミン D1 受容体が前頭前皮質 (PFC) と脳の線条体領域に存在し、認知1メモリ、一時的な処理、および機関車の動作2,3を含むに大きく影響,4,5,6,7. 以前の研究は、ドパミン D1 受容体の変化は、注意欠陥多動性障害 (ADHD)8、統合失調症9,の神経認知症状の進行と関連付けられたことを解明10ストレス感受性11。具体的には、統合失調症、陽電子放射断層撮影 (PET) 研究に認知障害や陰性症状11の存在する前頭皮質におけるドパミン D1 受容体の結合能が関連性が高いことが示されました。前頭前皮質のドーパミン D1 受容体による規制で興奮性ニューロンの樹枝状結晶の成長には、ストレス感受性が軽減されます。さらに、内側前頭前皮質 (mPFC) ニューロンの D1 受容体のノックダウンは、社会的敗北ストレス誘発性の社会的回避12を高めることができます。

RNAの in situハイブリダイゼーション新鮮凍結組織サンプルでのセルに単一の RNA 分子を可視化する手法を紹介します。現在の技術では、現在の文献内に存在する方法上の複数の利点を持っています。まず、現在のプロシージャは組織の空間的および形態学的コンテキストを保存し、他のプロシージャは、新鮮なを必要とする、非埋め込まれた組織は、現在の方法と組み合わせることができるように新鮮凍結組織サンプルで行った。ホルマリン固定パラフィン包埋組織における同様の手順は、単一の転写の解像度は、RNAの in situハイブリダイゼーション テクニック13を使用して達成することができます説明しています。単一の転写レベルで RNA の検出は、低コピー数の表現だけでなく、核酸検出の他の方法では達成できない細胞レベルでの遺伝子発現を比較する機会に優れた感度を提供しますポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のテクニック」などさらに、現在のメソッドは、単一のターゲット RNA 転写産物にハイブリダイズと検出信号増幅の分子カスケードを順番にバインドされている、非常に特定の RNA プローブを介して高い信号対雑音比の画像を維持します。システム。最後に、現在の技術によるタンパク質検出などのシステム関連マーカーの 1 つだけのクラスに私たちの調査を制限するのではなく、そのターゲット固有の専用プローブでは、複数の生物学的システムを評価する機会を提供します免疫組織化学的方法。

私たちの研究では、側坐核 (NAc) Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) でチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価する男性と女性/N の F344 ラットの交配その場で新規 RNA を使いました。交配その場で革新的な RNA では、DA 取り込みと DA 放出の両方に同時に影響を及ぼす、線条体ドパミン DA システムの複雑さの理解を向上させるメカニズムを調査することができました。新鮮凍結脳をスライスし、さまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供するため、我々 はプロシージャを記述するここでは、:「離散ドット」または「クラスター」。

Protocol

実験プロトコルは、動物のケアおよび使用委員会 (IACUC)、サウスカロライナ州の大学によって承認された (連邦保証番号: A3049-01)。 1. 新鮮な冷凍脳セクションの準備 N/F344 ラット系統を使用: 各性のラット 3 匹 13 ヵ月齢、本体重量約 320 g。 5% (セボフルランの過剰摂取) のセボフルラン濃度を調整します。呼吸停止の追加分、後セボフルラン投与を続行します…

Representative Results

現在の研究は観察/N の F344 ラット (図 1 a) で NAc のドーパミン D1-アルファ受容体 (Drd1α) における RNA 発現のパターンを汚す「離散ドット」です。個々 の蛍光信号は容易に識別された、セル内の 1 つの RNA 転写産物を表す単一の「ドット」として見ることができます。「離散ドット」染色パターンを表示する、NAc からイメージの半定量分析 (<strong …

Discussion

このプロトコルに交配その場で新鮮凍結脳スライス (NAc) 側坐核における Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) 地域におけるチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価するための手法について述べる。我々 はまたさまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供:「離散ドット」または「クラスター」。

交配分析その場で成功した多重蛍光 RNA のための重要なス?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本作品は、国立衛生研究所 HD043680、MH106392、DA013137、および NS100624 の健康 (NIH) の補助金によって支えられました。部分的な基金は、医用生体行動科学 NIH T32 のトレーニングの許可によって提供されました。

Materials

HybEZ Oven system Advanced Cell Diagnostics  310010
RNAscope Probe – Rn-Drd1a Advanced Cell Diagnostics  317031 Color channel 1, Green
RNAscope Probe – Rn-Th-C2 Advanced Cell Diagnostics  314651-C2 Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics  320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratory H-4000
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154% 
4% paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rack Fisher Scientific NC9837976
Tissue-Tek staining dish Fisher Scientific NC0731403
Precision General Purpose Baths ThermoFisher Scientific TSGP28
Pretreatment 4 Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagent Life Technologies P36930
Amp 1-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 2-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 3-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 4-FL-Alt A Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
EZ-C1 software package Nikon Instruments version 3.81b
SAS/STAT Software SAS Institute, Inc., version 9.4

Referências

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Citar este artigo
Li, H., Illenberger, J. M., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology. J. Vis. Exp. (133), e57444, doi:10.3791/57444 (2018).

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