Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması
Summary
Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.
Abstract
Merkezi sinir sistemi nöronal büyüme ve gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynar en bol (DA) dopamin reseptör D1-Alfa alt türü reseptör (Drd1α) olduğunu. Ancak, davranışsal yanıt arabuluculuk ve çalışma bellek işlevi modülasyonlu Drd1α reseptör anormallikler temel mekanizmaları hala pek açık değildir. Bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil kullanarak, geçerli çalışma Drd1α dopamin reseptör ve tirozin hidroksilaz (TH) RNA ifadeden DA ilgili devre nucleus accumbens (NAc) alan ve gözlemliyorum nigra bölgesinde (SNR), tespit anılan sıraya göre. Kak Drd1α ifadede “ayrı nokta deseni boyama” gösterir. Drd1α ifade açık cinsiyet farklılıkları tespit edildi. Buna ek olarak, TH “kümelenmiş” boyama desen gösterir. TH ifade ile ilgili dişi rats erkek hayvanlar göreli hücre başına daha yüksek bir sinyal ifadesi görüntülenir. Burada sunulan yöntemleri bir roman situ hibridizasyon Teknik Merkezi sinir sistemi hastalıkları ilerleme sırasında dopamin sistem disfonksiyon değişimler soruşturma için sağlar.
Introduction
Disfonksiyon striatal dopamin sisteminin birden çok nörobilişsel hastalıklarda gözlenen klinik belirtiler ilerlemesini ilgilenmektedir. Dopamin D1 reseptörleri prefrontal korteks (PFC) ve beynin striatal bölgeler varsa ve Bilişsel süreçler1bellek, zamansal işleme ve lokomotif davranış2,3 çalışmak dahil olmak üzere, ağır etkisi , 4 , 5 , 6 , 7. önceki çalışmalar aydınlatılmamıştır değişiklikleri reseptörlerinin dopamin D1 ilerlemesini dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB)8, şizofreni9, nörobilişsel belirtiler ile ilişkili bulunmuştur 10 ve stres duyarlılık11. Özellikle, şizofreni, Pozitron emisyon tomografisi (PET) çalışmalar dopamin D1 reseptörleri prefrontal cortices bağlama yeteneği son derece bilişsel açıkları ve negatif belirtiler11varlığı ile ilgili belirtti. D1 dopamin reseptör tarafından düzenlenir prefrontal korteks eksitatör nöronlar dendritik büyüme stres duyarlılık azaltır. Ayrıca, D1 reseptör medial prefrontal kortikal (mPFC) nöronlar içinde nakavt sosyal yenilgi sosyal kaçınma stres kaynaklı12geliştirmek.
Burada, tek RNA molekülleri ile taze donmuş doku örneklerini bir hücre görselleştirmek için RNA in situ hibridizasyon roman tekniği tanıtmak. Mevcut teknik içinde geçerli edebiyat mevcut yöntemleri üzerinde birden çok avantajları vardır. İlk olarak, geçerli yordam doku kayma ve morfolojik bağlamında korur ve böylece taze gerektiren diğer yordamlar, gömülü olmayan doku geçerli yöntemleri ile kombine taze donmuş doku örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Formalin sabit ve parafin gömülü dokularda benzer yordamlar tek transkripsiyon çözünürlük bir RNA in situ hibridizasyon tekniği13kullanılarak elde edilebilir gösterildiği. RNA tek transkripsiyon düzeyinde algılanması üstün hassasiyet düşük kopya numara ifadesi hem de diğer nükleik asit algılama yöntemlerle elde tek tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu karşılaştırmak için fırsat sağlar, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri gibi. Ayrıca, geçerli yöntem için tek hedef RNA transkript melezleşmiştir ve sıralı olarak algılama sinyali amplifikasyon molekülleri bir çağlayan ile bağlı çok özel RNA probları ile imge ile yüksek sinyal gürültü oranı korur sistem. Son olarak, günümüz teknolojisi soruşturmamız için yalnızca bir sınıf sistemi ile ilgili işaretleri tarafından protein algılaması gibi sınırlama yerine onun hedef özgü özel probları ile birden çok biyolojik sistemleri değerlendirmek için fırsat sağlar immünhistokimya yöntemleri.
Bizim çalışmada, biz bu roman RNA in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve gözlemliyorum nigra (SNR) tirozin hidroksilaz (TH) ifadesinde değerlendirmek için her ikisi erkek ve dişi F344/N fareler kullandık. Yenilikçi RNA in situ hibridizasyon DA alımı ve DA yayın aynı anda etkileyen, striatal DA sistemin karmaşıklığı anlayışımızı geliştirmek mekanizmaları incelemek için bize etkin. Taze donmuş beyin dilimler ve veri analiz yöntemleri farklı boyama desenleri için sağlamak için burada, biz açıklayınız: “ayrı nokta” veya “kümeler”.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve tirozin hidroksilaz (TH) ifade gözlemliyorum nigra (SNR) bölgesinde değerlendirmek için taze donmuş beyin dilimler için roman tekniği tarif. Ayrıca farklı boyama desenleri için veri analizi yöntemleri sağlar: “ayrı nokta” veya “kümeler”.
Başarılı multiplex Floresans RNA in situ hibridizasyon tahlil için kritik adımlar dahil edilir. Don sıçan decapitating ve beyin, ka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mevcut işleri Sağlık (NIH) hibe HD043680, MH106392, DA013137 ve NS100624 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklendi. Kısmi Fonu Biyomedikal davranış bilimleri NIH T32 eğitim grant tarafından sağlandı.
Materials
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
Referências
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neurociência. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neurociência. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).
