Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un’area specifica del cervello.
Nel sistema nervoso centrale, il recettore di sottotipo D1-alfa (Drd1α) è il più abbondante recettore della dopamina (DA), che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dello sviluppo e crescita neuronale. Tuttavia, i meccanismi alla base di Drd1α anomalie di recettori che mediano le risposte comportamentali e modulazione della funzione di memoria di lavoro sono ancora poco chiari. Usando un romanzo RNA in situ ibridazione analisi, lo studio corrente ha identificato dopamina Drd1α del recettore e la tirosina idrossilasi (TH) espressione del RNA da correlati DA circuiti nella zona di nucleo accumbens (NAc) e regione di substantia nigra (SNR), rispettivamente. Drd1α espressione nel NAc Mostra un “discreto punto” modello di macchiatura. Sono state osservate differenze di sesso chiaro nell’espressione di Drd1α. Al contrario, TH Mostra un pattern di colorazione “cluster”. Per quanto riguarda l’espressione TH, ratti femminili visualizzata un’ più alta espressione di segnale per cella rispetto gli animali maschii. I metodi presentati qui forniscano una tecnica di romanzo in situ di ibridazione per indagare i cambiamenti nella disfunzione del sistema della dopamina durante la progressione di malattie del sistema nervoso centrale.
Disfunzione del sistema della dopamina striatale è coinvolto nella progressione dei sintomi clinici osservati nelle malattie neurocognitive multiple. I ricevitori della dopamina D1 sono presenti nella corteccia prefrontale (PFC) e regioni striatal del cervello e influenzano pesantemente i processi cognitivi1, compreso il funzionamento memoria, elaborazione temporale e comportamento locomotiva2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. precedenti studi chiarito che le modifiche dei ricevitori della dopamina D1 sono state associate con la progressione di attenzione iperattività di deficit disorder (ADHD)8, i sintomi neurocognitivi nella schizofrenia9, 10 e lo stress suscettibilità11. In particolare, nella schizofrenia, tomografia a emissione di positroni (PET) studi hanno indicato che la capacità di legame dei recettori D1 della dopamina nelle cortecce prefrontali era altamente relative al deficit cognitivi e la presenza di sintomi negativi11. La crescita dendritica dei neuroni eccitatori nella corteccia prefrontale regolato dal recettore della dopamina D1 allevia lo stress suscettibilità. Inoltre, l’atterramento del recettore D1 in neuroni corticali prefrontale mediale (mPFC) potrebbe migliorare la sconfitta sociale indotta da stress sociale evitare12.
Qui, presentiamo una nuova tecnica di RNA in situ ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in una cella con campioni di tessuto fresco congelato. La tecnica attuale ha molteplici vantaggi rispetto ai metodi che esistono all’interno della letteratura corrente. In primo luogo, l’attuale procedura per mantenere il contesto spaziale e morfologico del tessuto ed è stata effettuata su campioni di tessuto fresco congelato affinché altre procedure che richiedono fresco, non incorporati tessuti possono essere combinati con i metodi attuali. Procedure analoghe nei tessuti formalina-fisso e paraffina-incastonati hanno illustrato che risoluzione singola trascrizione può essere realizzato usando un RNA in situ ibridazione tecnica13. Rilevamento del RNA a livello di singola trascrizione fornisce una sensibilità superiore alla espressione di numero di copia basso così come l’opportunità di confrontare l’espressione genica a livello di singole cellule che non possono essere raggiunti da altri metodi di rilevazione dell’acido nucleico, quali tecniche di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Inoltre, il metodo corrente mantiene immagini con un elevato rapporto segnale-rumore attraverso le sonde del RNA altamente specifiche che sono ibridate di trascritti di RNA bersaglio singolo e associate in sequenza con una cascata di molecole di amplificazione del segnale nella rilevazione sistema. Infine, l’attuale tecnologia offre l’opportunità di valutare più sistemi biologici con sue sonde proprietarie di target-specifici, piuttosto che limitare la nostra ricerca ad una sola classe di indicatori relativi al sistema quali il rilevamento di proteine di metodi di esame immuno-istochimico.
Nel nostro studio, abbiamo usato questa romanzo ibridazione in situ per RNA per valutare l’espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l’espressione di tirosina idrossilasi (TH) nella substantia nigra (SNR) dei ratti F344/N sia maschili che femminili. L’innovativo ibridazione in situ per RNA permesso di studiare i meccanismi che influenzano sia DA assorbimento e rilascio di DA simultaneamente, migliorando la nostra comprensione della complessità del sistema striatal del DA. Qui, descriviamo la procedura per fette di cervello fresco-congelato e fornire i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: “discreto punto” o “cluster”.
In questo protocollo, descriviamo una tecnica novella di ibridazione in situ per fette di cervello fresco congelato per valutare l’espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l’espressione di tirosina idrossilasi (TH) in regione della substantia nigra (SNR). Forniamo anche i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: “discreto punto” o “cluster”.
I passaggi critici per un’analisi di fluorescenza multisala successo RNA in situ di ibridaz…
The authors have nothing to disclose.
Le opere presenti sono state sostenute dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624. Fondo parziale è stato fornito da una sovvenzione di formazione NIH T32 nella scienza biomedica-comportamentale.
HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |