בידוד מבוסס זיקה כימית של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים לצורך פרוטאומיקה וניתוח פוספופרוטאומיקה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מפורטים לבידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות בשתן באמצעות חרוזים מגנטיים פונקציונליים. יתר על כן, הוא מקיף ניתוחים מאוחרים יותר, כולל כתמים מערביים, פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מנוזלים ביולוגיים זכו לאחרונה לתשומת לב משמעותית בתחום הביופסיה הנוזלית. הם משוחררים כמעט על ידי כל סוג של תא, מספקים תמונת מצב בזמן אמת של תאים מארחים ומכילים שפע של מידע מולקולרי, כולל חלבונים, במיוחד אלה עם שינויים לאחר תרגום (PTM) כגון זרחון, כשחקן העיקרי של תפקודי התא והתפרצות המחלה והתקדמותה. עם זאת, הבידוד של כלי רכב חשמליים מנוזלים ביולוגיים נותר מאתגר בשל תפוקות נמוכות וזיהומים משיטות הבידוד הנוכחיות של כלי רכב חשמליים, מה שהופך את הניתוח במורד הזרם של מטעני EV, כגון פוספופרוטאינים של EV, לקשה. במאמר זה אנו מתארים שיטת בידוד מהירה ויעילה של כלי רכב חשמליים המבוססת על חרוזים מגנטיים פונקציונליים לבידוד EV מנוזלים ביולוגיים כגון שתן אנושי וניתוח פרוטאומיקה ופוספופרוטאומיקה במורד הזרם לאחר בידוד EV. הפרוטוקול איפשר תשואת התאוששות גבוהה של כלי רכב חשמליים בשתן ופרופילים רגישים של פרוטאום EV ופוספופרוטום. יתר על כן, הרבגוניות של פרוטוקול זה ושיקולים טכניים רלוונטיים מטופלים גם כאן.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים עטופים בקרום המופרשים על ידי כל סוגי התאים ונמצאים בנוזלים ביולוגיים כגון דם, שתן, רוק וכו’.1,2,3,4. כלי רכב חשמליים נושאים מטען של מולקולות ביו-אקטיביות מגוונות המשקפות את המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התאים המארחים שלהם, ולכן מתפקדות כגורמים מכריעים בהתקדמות המחלה 4,5,6. יתר על כן, מחקרים מקיפים קבעו כי ניתן לזהות סמני מחלה מבוססי EV לפני הופעת הסימפטומים או גילוי פיזיולוגי של גידולים 5,6,7.
זרחן פועל כמנגנון מפתח באיתות ובוויסות תאי. לכן, פוספופרוטאינים מספקים מקור רב ערך לגילוי סמנים ביולוגיים מכיוון שאירועי זרחן חריגים קשורים למסלולי איתות תאיים לא מווסתים ולהתפתחות מחלות גרורתיות כגון סרטן 8,9,10. למרות שיצירת פרופיל של דינמיקת זרחן מאפשרת זיהוי של חתימות פוספופרוטאין ספציפיות למחלה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים, השפע הנמוך והאופי הדינמי של פוספופרוטאינים מציבים אתגרים גדולים בפיתוח פוספופרוטאינים כסמנים ביולוגיים11,12. יש לציין כי הפוספופרוטאינים בעלי השפע הנמוך הכלולים ברכב חשמלי מוגנים מפני עיכול אנזימטי חיצוני בסביבה חוץ-תאית8. כתוצאה מכך, כלי רכב חשמליים ופוספופרוטאינים שמקורם ברכב חשמלי מציעים מקור אידיאלי לגילוי סמנים ביולוגיים בגילוי מוקדם של סרטן ומחלות אחרות.
למרות שניתוח של זרחן חלבונים בכלי רכב חשמליים מציע משאב רב ערך להבנת איתות סרטן ואבחון מחלות בשלב מוקדם, היעדר שיטות יעילות לבידוד רכב חשמלי מהווה חסם משמעותי. בידוד EV מושג בדרך כלל באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (DUC)13. עם זאת, שיטה זו גוזלת זמן ואינה מתאימה להשלכות קליניות בשל תפוקה נמוכה ויכולת שחזור ירודה13,14. גישות חלופיות לבידוד EV, כגון משקעים15 המושרים על ידי פולימרים, מוגבלות על ידי ספציפיות נמוכה עקב משקעים משותפים של חלבונים שאינם EV. גישות מבוססות זיקה, כולל לכידת זיקה מבוססת נוגדנים16 וסינון זיקה17, מציעות ספציפיות משופרת אך מוגבלות לשיעור התאוששות נמוך יחסית עקב נפח קטן.
כדי להתמודד עם הבעיות בחקר דינמיקת הפוספופרוטאינים בכלי רכב חשמליים, הקבוצה שלנו פיתחה טכניקת שחזור וטיהור כולל של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVtrap) המבוססת על זיקה כימית ללכידת כלי רכב חשמליים על גבי חרוזים מגנטיים פונקציונליים18. תוצאות קודמות הראו כי שיטת בידוד EV מבוססת חרוזים מגנטיים זו יעילה ביותר בבידוד כלי רכב חשמליים ממגוון רחב של דגימות נוזל ביולוגי ומסוגלת להשיג תפוקת EV גבוהה בהרבה תוך מזעור הזיהום בהשוואה ל- DUC ושיטות בידוד קיימות אחרות18,19. השתמשנו בהצלחה ב-EVtrap ובשיטת העשרת פוספו-פפטידים מבוססת טיטניום שפותחה על ידי קבוצה20 שלנו כדי ליצור פרופיל של פוספופרוטאום של כלי רכב חשמליים שמקורם בנוזלים ביולוגיים מגוונים ולזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים של פוספופרוטאין למחלות שונות 19,21,22.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על EVtrap לבידוד של כלי רכב חשמליים במחזור. הפרוטוקול מתמקד ברכבים חשמליים בדרכי השתן. כמו כן, אנו מדגימים אפיון של כלי רכב חשמליים מבודדים באמצעות כתם מערבי. לאחר מכן אנו מפרטים את הכנת הדגימה ורכישת ספקטרומטריית מסה (MS) הן עבור ניתוח פרוטאומיקה והן עבור ניתוח פוספופרוטאומיקה. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה וניתנת לשחזור עבור פרופיל של פרוטאום EV בשתן ופוספופרוטום, אשר יאפשר מחקרים נוספים על כלי רכב חשמליים והיישומים הקליניים שלהם23.
Protocol
Representative Results
Discussion
בידוד יעיל של EV הוא תנאי מוקדם חיוני לאיתור חלבונים ופוספופרוטאינים בשפע נמוך בכלי רכב חשמליים. למרות פיתוחן של שיטות רבות למילוי צורך זה, רובן עדיין סובלות ממגבלות כגון התאוששות לקויה או יכולת שחזור נמוכה, המעכבות את השימוש בהן במחקרים רחבי היקף ובמסגרות קליניות שגרתיות. DUC נחשבת בדרך כל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענקי NIH 3RF1AG064250 ו- R44CA239845.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
- Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
