Isolamento chimico basato sull'affinità di vescicole extracellulari da biofluidi per analisi proteomiche e fosfoproteomiche

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle incapsulate nella membrana secrete da tutti i tipi di cellule e sono presenti in biofluidi come sangue, urina, saliva, ecc.1,2,3,4. Le vescicole extracellulari trasportano un carico di diverse molecole bioattive che riflettono lo stato fisiologico e patologico delle loro cellule ospiti e, quindi, funzionano come fattori cruciali nella progressione della malattia ^4,5,6. Inoltre, studi approfonditi hanno stabilito che i marcatori di malattia basati sulle vescicole extracellulari possono essere identificati prima dell’insorgenza dei sintomi o del rilevamento fisiologico dei tumori ^5,6,7.

La fosforilazione agisce come un meccanismo chiave nella segnalazione e nella regolazione cellulare. Pertanto, le fosfoproteine forniscono una fonte preziosa per la scoperta di biomarcatori poiché eventi di fosforilazione aberranti sono associati a vie di segnalazione cellulare disregolate e allo sviluppo di malattie metastatiche come il cancro ^8,9,10. Sebbene la profilazione delle dinamiche di fosforilazione consenta l’identificazione di firme fosfoproteiche specifiche della malattia come potenziali biomarcatori, la bassa abbondanza e la natura dinamica delle fosfoproteine pongono grandi sfide nello sviluppo delle fosfoproteine come biomarcatori^11,12. In particolare, le fosfoproteine poco abbondanti incapsulate all’interno delle vescicole extracellulari sono protette dalla digestione enzimatica esterna nell’ambiente extracellulare⁸. Di conseguenza, le vescicole extracellulari e le fosfoproteine derivate da EV offrono una fonte ideale per la scoperta di biomarcatori nella diagnosi precoce del cancro e di altre malattie.

Sebbene l’analisi della fosforilazione delle proteine nelle vescicole extracellulari offra una risorsa preziosa per comprendere la segnalazione del cancro e la diagnosi precoce della malattia, la mancanza di metodi efficienti di isolamento delle vescicole extracellulari rappresenta un ostacolo importante. L’isolamento delle vescicole extracellulari è comunemente ottenuto attraverso l’ultracentrifugazione differenziale (DUC)¹³. Tuttavia, questo metodo richiede molto tempo e non è adatto per le implicazioni cliniche a causa della bassa produttività e della scarsa riproducibilità^13,14. Gli approcci alternativi di isolamento delle EV, come la precipitazione indotta da polimeri¹⁵, sono limitati dalla bassa specificità dovuta alla co-precipitazione delle proteine non-EV. Gli approcci basati sull’affinità, tra cui la cattura dell’affinità basata sugli anticorpi¹⁶ e la filtrazione dell’affinità¹⁷, offrono una maggiore specificità, ma sono limitati a un tasso di recupero relativamente basso a causa del volume ridotto.

Per affrontare i problemi nell’esplorazione della dinamica delle fosfoproteine nelle vescicole extracellulari, il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica di recupero e purificazione totale delle vescicole extracellulari (EVtrap) basata sull’affinità chimica per catturare le vescicole extracellulari su microsfere magnetiche funzionalizzate¹⁸. Risultati precedenti hanno dimostrato che questo metodo di isolamento delle vescicole extracellulari basato su microsfere magnetiche è altamente efficace nell’isolare le vescicole extracellulari da un’ampia gamma di campioni di biofluidi ed è in grado di ottenere una resa di vescicole extracellulari molto più elevata, riducendo al minimo la contaminazione rispetto al DUC e ad altri metodi di isolamento esistenti^18,19. Abbiamo utilizzato con successo EVtrap e un metodo di arricchimento di fospopeptidi a base di titanio sviluppato dal nostro gruppo²⁰ per profilare il fosfoproteoma di vescicole extracellulari derivate da diversi biofluidi e per rilevare potenziali biomarcatori fosfoproteici per varie malattie 19,21,22.

Qui presentiamo un protocollo basato su EVtrap per l’isolamento delle vescicole extracellulari circolanti. Il protocollo si concentra sulle vescicole extracellulari urinarie. Dimostriamo anche la caratterizzazione di vescicole extracellulari isolate utilizzando il western blotting. Descriviamo quindi in dettaglio la preparazione del campione e l’acquisizione della spettrometria di massa (MS) per le analisi di proteomica e fosfoproteomica. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro efficiente e riproducibile per la profilazione del proteoma e del fosfoproteoma delle vescicole extracellulari urinarie, che faciliterà ulteriori studi sulle vescicole extracellulari e sulle loro applicazioni cliniche²³.