Isolement par affinité chimique de vésicules extracellulaires à partir de biofluides pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique
Summary
Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées. De plus, il englobe des analyses ultérieures, y compris le western blot, la protéomique et la phosphoprotéomique.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) issues de biofluides ont récemment fait l’objet d’une attention particulière dans le domaine de la biopsie liquide. Libérés par presque tous les types de cellules, ils fournissent un instantané en temps réel des cellules hôtes et contiennent une multitude d’informations moléculaires, y compris les protéines, en particulier celles présentant des modifications post-traductionnelles (PTM) telles que la phosphorylation, en tant que principal acteur des fonctions cellulaires et de l’apparition et de la progression de la maladie. Cependant, l’isolement des VE des biofluides reste difficile en raison des faibles rendements et des impuretés des méthodes actuelles d’isolation des VE, ce qui rend difficile l’analyse en aval de la cargaison des VE, comme les phosphoprotéines des VE. Nous décrivons ici une méthode d’isolement rapide et efficace des VE basée sur des billes magnétiques fonctionnalisées pour l’isolement des VE à partir de biofluides tels que l’urine humaine et l’analyse protéomique et phosphoprotéomique en aval après l’isolement des VE. Le protocole a permis un rendement élevé de récupération des VE urinaires et des profils sensibles du protéome et du phosphoprotéome des VE. En outre, la polyvalence de ce protocole et les considérations techniques pertinentes sont également abordées ici.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules encapsulées dans une membrane sécrétées par tous les types de cellules et présentes dans les biofluides tels que le sang, l’urine, la salive, etc.1,2,3,4. Les VE transportent une cargaison de diverses molécules bioactives qui reflètent l’état physiologique et pathologique de leurs cellules hôtes et fonctionnent donc comme des facteurs cruciaux dans la progression de la maladie 4,5,6. De plus, des études approfondies ont établi que les marqueurs de la maladie basés sur les VE peuvent être identifiés avant l’apparition des symptômes ou la détection physiologique des tumeurs 5,6,7.
La phosphorylation agit comme un mécanisme clé dans la signalisation et la régulation cellulaires. Par conséquent, les phosphoprotéines constituent une source précieuse pour la découverte de biomarqueurs, car les événements de phosphorylation aberrants sont associés à des voies de signalisation cellulaire déréglées et au développement de maladies métastatiques telles que le cancer 8,9,10. Bien que le profilage de la dynamique de phosphorylation permette d’identifier des signatures phosphoprotéiques spécifiques à la maladie en tant que biomarqueurs potentiels, la faible abondance et la nature dynamique des phosphoprotéines posent des défis majeurs dans le développement de phosphoprotéines en tant que biomarqueurs11,12. Notamment, les phosphoprotéines peu abondantes encapsulées dans les VE sont protégées de la digestion enzymatique externe dans l’environnement extracellulaire8. Par conséquent, les VE et les phosphoprotéines dérivées des VE constituent une source idéale pour la découverte de biomarqueurs dans la détection précoce du cancer et d’autres maladies.
Bien que l’analyse de la phosphorylation des protéines dans les VE offre une ressource précieuse pour comprendre la signalisation du cancer et le diagnostic précoce de la maladie, le manque de méthodes efficaces d’isolement des VE constitue un obstacle majeur. L’isolation des VE est généralement obtenue par ultracentrifugation différentielle (DUC)13. Cependant, cette méthode prend du temps et n’est pas adaptée aux implications cliniques en raison d’un faible débit et d’une mauvaise reproductibilité13,14. D’autres approches d’isolement des VE, telles que la précipitation induite par les polymères15, sont limitées par une faible spécificité due à la coprécipitation de protéines non VE. Les approches basées sur l’affinité, y compris la capture d’affinité basée sur les anticorps16 et la filtration d’affinité17, offrent une spécificité accrue, mais sont limitées à un taux de récupération relativement faible en raison du faible volume.
Pour répondre aux enjeux de l’exploration de la dynamique des phosphoprotéines dans les VE, notre groupe a développé une technique de récupération et de purification totale des vésicules extracellulaires (EVtrap) basée sur l’affinité chimique pour capturer les VE sur des billes magnétiques fonctionnalisées18. Des résultats antérieurs ont démontré que cette méthode d’isolement des VE à base de billes magnétiques est très efficace pour isoler les VE d’une large gamme d’échantillons de biofluides et qu’elle est capable d’obtenir un rendement beaucoup plus élevé tout en minimisant la contamination par rapport à la DUC et à d’autres méthodes d’isolement existantes18,19. Nous avons utilisé avec succès EVtrap et une méthode d’enrichissement en phosphopeptide à base de titane développée par notre groupe20 pour profiler le phosphoprotéome des VE dérivés de divers biofluides et pour détecter des biomarqueurs phosphoprotéiques potentiels pour diverses maladies 19,21,22.
Nous présentons ici un protocole basé sur EVtrap pour l’isolement des VE en circulation. Le protocole se concentre sur les VE urinaires. Nous démontrons également la caractérisation de VE isolés à l’aide du western blot. Nous détaillons ensuite la préparation des échantillons et l’acquisition par spectrométrie de masse (MS) pour les analyses protéomiques et phosphoprotéomiques. Ce protocole fournit un flux de travail efficace et reproductible pour le profilage du protéome et du phosphoprotéome urinaires des VE, ce qui facilitera d’autres études sur les VE et leurs applications cliniques23.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’isolement efficace des VE est une condition préalable essentielle à la détection de protéines et de phosphoprotéines peu abondantes dans les VE. Malgré le développement de nombreuses méthodes pour répondre à ce besoin, la majorité d’entre eux souffrent encore de limitations telles qu’une mauvaise récupération ou une faible reproductibilité, ce qui entrave leur utilisation dans les études à grande échelle et les contextes cliniques de routine. Le DUC est généralement considéré comme la méthod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés en partie par les subventions 3RF1AG064250 et R44CA239845 du NIH.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
- Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
