プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

細胞外小胞(EV)は、あらゆる種類の細胞から分泌される膜内包ナノ粒子であり、血液、尿、唾液などの体液中に存在します1,2,3,4。EVは、宿主細胞の生理学的および病理学的状態を反映する多様な生理活性分子の貨物を運んでいるため、疾患の進行における重要な要因として機能します^4,5,6。さらに、広範な研究により、症状の発症または腫瘍の生理学的検出の前に、EVベースの疾患マーカーを特定できることが確立されています^5,6,7。

リン酸化は、細胞のシグナル伝達と調節における重要なメカニズムとして作用します。したがって、リン酸化タンパク質は、異常なリン酸化イベントが細胞シグナル伝達経路の調節不全や癌などの転移性疾患の発症と関連しているため、バイオマーカー発見のための貴重な情報源を提供します^8,9,10。リン酸化動態のプロファイリングにより、疾患特異的なリン酸化タンパク質シグネチャーを潜在的なバイオマーカーとして同定することができますが、リン酸化タンパク質の存在量が少なく、動的な性質は、バイオマーカーとしてのリン酸化タンパク質の開発において大きな課題となっています^11,12。特に、EV内に内包された低存在量のリン酸化タンパク質は、細胞外環境での外部酵素消化から保護されています⁸。したがって、EVおよびEV由来のリン酸化タンパク質は、がんやその他の疾患の早期発見におけるバイオマーカー発見の理想的な情報源となります。

EVにおけるタンパク質のリン酸化の解析は、がんのシグナル伝達と早期疾患診断を理解するための貴重なリソースを提供しますが、効率的なEV分離法の欠如が大きな障壁となっています。EVの絶縁は、通常、差動超遠心分離(DUC)によって実現されます¹³。しかし、この方法は時間がかかり、スループットが低く再現性が低いため、臨床的な意味合いには適していません^13,14。ポリマー誘起沈殿¹⁵などの代替EV単離アプローチは、非EVタンパク質の共沈による特異性の低さによって制限される。抗体ベースのアフィニティー捕捉¹⁶ やアフィニティー濾過¹⁷ などのアフィニティーベースのアプローチは、特異性を高めますが、容量が少ないため、回収率が比較的低く制限されます。

EVのリン酸化蛋白質動態を探る上での課題を解決するため、当グループでは、EVを機能性磁気ビーズに捕捉する化学的親和性に基づく細胞外小胞全回収精製(EVtrap)技術を開発しました¹⁸。これまでの結果から、この磁気ビーズベースのEV分離法は、幅広い生体液サンプルからEVを分離するのに非常に効果的であり、DUCや他の既存の分離方法と比較して、汚染を最小限に抑えながらはるかに高いEV収率を達成できることが実証されています^18,19。私たちは、EVtrapと私たちのグループによって開発されたチタンベースのリン酸化ペプチド濃縮法を利用することに成功しました²⁰ 多様な生体液に由来するEVのリン酸化プロテオームをプロファイリングし、さまざまな疾患の潜在的なリン酸化タンパク質バイオマーカーを検出します19,21,22。

ここでは、流通するEVを分離するためのEVtrapに基づくプロトコルを紹介します。このプロトコルは、尿路EVに焦点を当てています。また、ウェスタンブロッティングを用いた絶縁型EVの特性評価についても実証しています。次に、プロテオミクス分析とリン酸化プロテオミクス分析の両方のためのサンプル調製と質量分析(MS)取得について詳しく説明します。このプロトコルは、尿中EVプロテオームとリン酸化プロテオームをプロファイリングするための効率的で再現性のあるワークフローを提供し、EVとその臨床応用に関するさらなる研究を促進します²³。