Summary

Isolamento Químico por Afinidade de Vesículas Extracelulares de Biofluidos para Análise Proteômica e Fosfoproteômica

Published: October 27, 2023
doi:

Summary

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.

Abstract

Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.

Introduction

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença 4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marcadores da doença baseados em EV podem ser identificados antes do início dos sintomas ou da detecção fisiológica de tumores5,6,7.

A fosforilação atua como um mecanismo chave na sinalização e regulação celular. Portanto, as fosfoproteínas fornecem uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores, uma vez que eventos aberrantes de fosforilação estão associados a vias de sinalização celular desreguladas e ao desenvolvimento de doenças metastáticas, como o câncer8,9,10. Embora a dinâmica de fosforilação do perfil permita a identificação de assinaturas de fosfoproteínas doença-específicas como potenciais biomarcadores, a baixa abundância e a natureza dinâmica das fosfoproteínas representam grandes desafios no desenvolvimento de fosfoproteínas como biomarcadores11,12. Notavelmente, as fosfoproteínas pouco abundantes encapsuladas em EVs são protegidas da digestão enzimática externa no ambiente extracelular8. Consequentemente, EVs e fosfoproteínas derivadas de EV oferecem uma fonte ideal para a descoberta de biomarcadores na detecção em estágio inicial de câncer e outras doenças.

Embora a análise da fosforilação de proteínas em EVs ofereça um recurso valioso para a compreensão da sinalização do câncer e do diagnóstico de doenças em estágio inicial, a falta de métodos eficientes de isolamento de EV apresenta uma grande barreira. O isolamento da EV é comumente obtido por ultracentrifugação diferencial (DUC)13. No entanto, esse método é demorado e não é adequado para implicações clínicas devido ao baixo rendimento e à baixa reprodutibilidade13,14. Abordagens alternativas de isolamento de EV, como a precipitação induzida por polímero15, são limitadas pela baixa especificidade devido à co-precipitação de proteínas não-EV. Abordagens baseadas em afinidade, incluindo captura de afinidade baseada em anticorpos16 e filtração por afinidade17, oferecem especificidade aprimorada, mas são restritas a uma taxa de recuperação relativamente baixa devido ao pequeno volume.

Para abordar as questões na exploração da dinâmica de fosfoproteínas em EVs, nosso grupo desenvolveu a técnica de recuperação e purificação total de vesículas extracelulares (EVtrap) baseada na afinidade química para capturar EVs em esferas magnéticas funcionalizadas18. Resultados anteriores demonstraram que este método de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas é altamente eficaz no isolamento de EVs de uma ampla gama de amostras de biofluidos e é capaz de alcançar um rendimento de EV muito maior, minimizando a contaminação em comparação com o DUC e outros métodos de isolamento existentes18,19. Utilizamos com sucesso o EVtrap e um método de enriquecimento de fosfopeptídeos à base de titânio desenvolvido por nosso grupo20 para traçar o perfil do fosfoproteoma de EVs derivados de diversos biofluidos e detectar potenciais biomarcadores de fosfoproteínas para várias doenças 19,21,22.

Aqui, apresentamos um protocolo baseado no EVtrap para o isolamento de EVs circulantes. O protocolo se concentra nos EVs urinários. Nós também demonstramos a caracterização de EVs isolados usando western blotting. Em seguida, detalhamos a preparação da amostra e a aquisição por espectrometria de massas (MS) para análises proteômicas e fosfoproteômicas. Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente e reprodutível para o perfil do proteoma urinário do EV e do fosfoproteoma, o que facilitará estudos adicionais sobre EVs e suas aplicações clínicas23.

Protocol

Todas as amostras de urina foram coletadas de indivíduos saudáveis após consentimento informado. Os experimentos estavam em conformidade com todos os padrões éticos envolvendo amostras humanas e em conformidade com as diretrizes do Programa de Proteção à Pesquisa em Seres Humanos da Universidade de Purdue. 1. Coleta de amostras Centrifugar 12 mL de amostra de urina em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL por 10 min a 2.500 x g, 4 °C para remover …

Representative Results

Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho abrangente desde o isolamento de EVs até análises proteômicas e fosfoproteômicas a jusante (Figura 1). As amostras de urina em triplicata foram submetidas ao isolamento EV. Os EVs isolados foram caracterizados por western blotting e subsequentemente processados para preparação de amostras proteômicas baseadas em espectrometria de massa, incluindo extração de proteínas, digestão enzimática e limpeza de peptídeos. Para a análise fosfo…

Discussion

O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios do NIH 3RF1AG064250 e R44CA239845.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Life Science Products M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1005
15 mL conical centrifuge tube Corning  352097
15 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074P2
Benchtop incubated shaker Bioer DIS-87999-3367802 Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13403S
Chloroacetamide Sigma -Aldrich C0267-100G Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate  Fisher Scientific  E145-4 Precipitates detergents
Evosep One  Evosep Liquid chromatography system
Evotips Evosep EV2013 Sample loading for Evosep One system 
EVtrap Tymora Analytical Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF Membrane Sigma -Aldrich IPFL00010 Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen NP0322BOX Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
PBS ThermoFisher 10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 Bruker  1893473 Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma -Aldrich P5726-5ML 100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma -Aldrich P0044-1ML 100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit Tymora Analytical Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate  Sigma -Aldrich D6750-10G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate  Sigma -Aldrich L9150-50G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT Bruker Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips  Glygen TT2C18.96 Desalting method
Triethylamine Sigma -Aldrich 471283-100ML For EV elution. 
Triethylammonium bicabonate buffer Sigma -Aldrich T7408-100ML 1 M
Trifluoroacetic acid Sigma -Aldrich 302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma -Aldrich C4706 Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX ThermoFisher PIA41007

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Cite This Article
Liu, Y., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, W. A. Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65844, doi:10.3791/65844 (2023).

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