O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.
Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.
As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença 4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marcadores da doença baseados em EV podem ser identificados antes do início dos sintomas ou da detecção fisiológica de tumores5,6,7.
A fosforilação atua como um mecanismo chave na sinalização e regulação celular. Portanto, as fosfoproteínas fornecem uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores, uma vez que eventos aberrantes de fosforilação estão associados a vias de sinalização celular desreguladas e ao desenvolvimento de doenças metastáticas, como o câncer8,9,10. Embora a dinâmica de fosforilação do perfil permita a identificação de assinaturas de fosfoproteínas doença-específicas como potenciais biomarcadores, a baixa abundância e a natureza dinâmica das fosfoproteínas representam grandes desafios no desenvolvimento de fosfoproteínas como biomarcadores11,12. Notavelmente, as fosfoproteínas pouco abundantes encapsuladas em EVs são protegidas da digestão enzimática externa no ambiente extracelular8. Consequentemente, EVs e fosfoproteínas derivadas de EV oferecem uma fonte ideal para a descoberta de biomarcadores na detecção em estágio inicial de câncer e outras doenças.
Embora a análise da fosforilação de proteínas em EVs ofereça um recurso valioso para a compreensão da sinalização do câncer e do diagnóstico de doenças em estágio inicial, a falta de métodos eficientes de isolamento de EV apresenta uma grande barreira. O isolamento da EV é comumente obtido por ultracentrifugação diferencial (DUC)13. No entanto, esse método é demorado e não é adequado para implicações clínicas devido ao baixo rendimento e à baixa reprodutibilidade13,14. Abordagens alternativas de isolamento de EV, como a precipitação induzida por polímero15, são limitadas pela baixa especificidade devido à co-precipitação de proteínas não-EV. Abordagens baseadas em afinidade, incluindo captura de afinidade baseada em anticorpos16 e filtração por afinidade17, oferecem especificidade aprimorada, mas são restritas a uma taxa de recuperação relativamente baixa devido ao pequeno volume.
Para abordar as questões na exploração da dinâmica de fosfoproteínas em EVs, nosso grupo desenvolveu a técnica de recuperação e purificação total de vesículas extracelulares (EVtrap) baseada na afinidade química para capturar EVs em esferas magnéticas funcionalizadas18. Resultados anteriores demonstraram que este método de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas é altamente eficaz no isolamento de EVs de uma ampla gama de amostras de biofluidos e é capaz de alcançar um rendimento de EV muito maior, minimizando a contaminação em comparação com o DUC e outros métodos de isolamento existentes18,19. Utilizamos com sucesso o EVtrap e um método de enriquecimento de fosfopeptídeos à base de titânio desenvolvido por nosso grupo20 para traçar o perfil do fosfoproteoma de EVs derivados de diversos biofluidos e detectar potenciais biomarcadores de fosfoproteínas para várias doenças 19,21,22.
Aqui, apresentamos um protocolo baseado no EVtrap para o isolamento de EVs circulantes. O protocolo se concentra nos EVs urinários. Nós também demonstramos a caracterização de EVs isolados usando western blotting. Em seguida, detalhamos a preparação da amostra e a aquisição por espectrometria de massas (MS) para análises proteômicas e fosfoproteômicas. Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente e reprodutível para o perfil do proteoma urinário do EV e do fosfoproteoma, o que facilitará estudos adicionais sobre EVs e suas aplicações clínicas23.
O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para a…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios do NIH 3RF1AG064250 e R44CA239845.
1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |