Aislamiento Basado en la Afinidad Química de Vesículas Extracelulares a partir de Biofluidos para Análisis de Proteómica y Fosfoproteómica
Summary
El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.
Abstract
Las vesículas extracelulares (VE) de los biofluidos han ganado recientemente una atención significativa en el campo de la biopsia líquida. Liberados por casi todos los tipos de células, proporcionan una instantánea en tiempo real de las células huésped y contienen una gran cantidad de información molecular, incluidas las proteínas, en particular aquellas con modificaciones postraduccionales (PTM) como la fosforilación, como el principal actor de las funciones celulares y la aparición y progresión de enfermedades. Sin embargo, el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de biofluidos sigue siendo un reto debido a los bajos rendimientos y las impurezas de los métodos actuales de aislamiento de los vehículos eléctricos, lo que dificulta el análisis posterior de la carga de los vehículos eléctricos, como las fosfoproteínas de los mismos. Aquí, describimos un método rápido y efectivo de aislamiento de EV basado en perlas magnéticas funcionalizadas para el aislamiento de EV de biofluidos como la orina humana y el análisis de proteómica y fosfoproteómica aguas abajo después del aislamiento de EV. El protocolo permitió un alto rendimiento de recuperación de las VE urinarias y perfiles sensibles del proteoma y el fosfoproteoma de las VE. Además, aquí también se abordan la versatilidad de este protocolo y las consideraciones técnicas pertinentes.
Introduction
Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas encapsuladas en membranas secretadas por todo tipo de células y están presentes en biofluidos como sangre, orina, saliva, etc.1,2,3,4. Los VE transportan una carga de diversas moléculas bioactivas que reflejan el estado fisiológico y patológico de sus células huésped y, por lo tanto, funcionan como factores cruciales en la progresión de la enfermedad 4,5,6. Además, amplios estudios han establecido que los marcadores de enfermedad basados en VE pueden identificarse antes de la aparición de los síntomas o de la detección fisiológica de los tumores 5,6,7.
La fosforilación actúa como un mecanismo clave en la señalización y regulación celular. Por lo tanto, las fosfoproteínas proporcionan una fuente valiosa para el descubrimiento de biomarcadores, ya que los eventos de fosforilación aberrantes se asocian con vías de señalización celular desreguladas y el desarrollo de enfermedades metastásicas como el cáncer 8,9,10. Aunque el perfil de la dinámica de fosforilación permite la identificación de firmas de fosfoproteínas específicas de la enfermedad como biomarcadores potenciales, la baja abundancia y la naturaleza dinámica de las fosfoproteínas plantean grandes desafíos en el desarrollo de fosfoproteínas como biomarcadores11,12. En particular, las fosfoproteínas de baja abundancia encapsuladas dentro de los VE están protegidas de la digestión enzimática externa en el entorno extracelular8. En consecuencia, las VE y las fosfoproteínas derivadas de las VE ofrecen una fuente ideal para el descubrimiento de biomarcadores en la detección temprana del cáncer y otras enfermedades.
Aunque el análisis de la fosforilación de proteínas en las VE ofrece un recurso valioso para comprender la señalización del cáncer y el diagnóstico de la enfermedad en etapa temprana, la falta de métodos eficientes de aislamiento de VE presenta una barrera importante. El aislamiento de EV se logra comúnmente a través de la ultracentrifugación diferencial (DUC)13. Sin embargo, este método requiere mucho tiempo y no tiene implicaciones clínicas debido al bajo rendimiento y la escasa reproducibilidad13,14. Los enfoques alternativos de aislamiento de EV, como la precipitación inducida por polímeros15, están limitados por la baja especificidad debido a la coprecipitación de proteínas no EV. Los enfoques basados en la afinidad, incluida la captura de afinidad basada en anticuerpos16 y la filtración de afinidad17, ofrecen una mayor especificidad, pero están restringidos a una tasa de recuperación relativamente baja debido al pequeño volumen.
Para abordar los problemas en la exploración de la dinámica de las fosfoproteínas en las VE, nuestro grupo ha desarrollado la técnica de recuperación y purificación total de vesículas extracelulares (EVtrap) basada en la afinidad química para capturar las VE en perlas magnéticas funcionalizadas18. Resultados anteriores han demostrado que este método de aislamiento de VE basado en perlas magnéticas es altamente efectivo para aislar EV de una amplia gama de muestras de biofluidos y es capaz de lograr un rendimiento de EV mucho mayor al tiempo que minimiza la contaminación en comparación con DUC y otros métodos de aislamiento existentes18,19. Hemos utilizado con éxito EVtrap y un método de enriquecimiento de fosfopéptidos a base de titanio desarrollado por nuestro grupo20 para perfilar el fosfoproteoma de los VE derivados de diversos biofluidos y para detectar potenciales biomarcadores de fosfoproteínas para diversas enfermedades 19,21,22.
A continuación, presentamos un protocolo basado en EVtrap para el aislamiento de vehículos eléctricos circulantes. El protocolo se centra en los EV urinarios. También demostramos la caracterización de EVs aislados mediante Western blot. A continuación, detallamos la preparación de la muestra y la adquisición por espectrometría de masas (MS) para los análisis proteómicos y fosfoproteómicos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo eficiente y reproducible para perfilar el proteoma y el fosfoproteoma urinarios de la VE, lo que facilitará la realización de nuevos estudios sobre las VE y sus aplicaciones clínicas23.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento eficaz de las VE es un requisito previo esencial para detectar proteínas y fosfoproteínas de baja abundancia en las VE. A pesar del desarrollo de numerosos métodos para satisfacer esta necesidad, la mayoría todavía sufren de limitaciones como una recuperación deficiente o una baja reproducibilidad, que impiden su utilización en estudios a gran escala y entornos clínicos rutinarios. El DUC se considera generalmente como el método más común para el aislamiento de los vehículos eléctricos, y los …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido financiado en parte por las subvenciones de los NIH 3RF1AG064250 y R44CA239845.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
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