Summary

Isolement, culture et induction adipogénique des cellules souches adipeuses originales dérivées de l’adipose de l’adipose de l’adiacisation périortique

Published: March 02, 2020
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Summary

Nous présentons un protocole pour l’isolement, la culture, et l’induction adipogenic des cellules souches adipeuses dérivées de crête neurale (NCADSCs) du tissu adipeux périortique de Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Les NCADSC peuvent être une source facilement accessible d’ADSCs pour la modélisation de l’adipogénèse ou de la lipogenèse in vitro.

Abstract

Une quantité excessive de tissu adipeux entourant les vaisseaux sanguins (tissu adipeux périvasculaire, également connu sous le nom de PVAT) est associée à un risque élevé de maladie cardio-vasculaire. Les ADSC dérivés de différents tissus adipeux présentent des caractéristiques distinctes, et ceux du PVAT n’ont pas été bien caractérisés. Dans une étude récente, nous avons rapporté que quelques ADSCs dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) descendent des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules migratrices provenant de l’ectoderm.

Dans cet article, nous décrivons un protocole pour isoler les nCCs étiquetés par protéines fluorescentes rouges (PD) de la PAAT de Wnt-1Cre.-; Rosa26RFP / souris et induire leur différenciation adipogénique in vitro. En bref, la fraction vasculaire stromal (SVF) est enzymatiquement dissociée de l’APA, et la DP crête neurale dérivée ADSCs (NCADSCs) sont isolés par le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Les NCADSC se différencient en adipocytes bruns et blancs, peuvent être cryoconservés et conservent leur potentiel adipogénique pour des passages de 3 à 5. Notre protocole peut générer des ADSC abondants à partir du PVAT pour la modélisation de l’adipogénèse PVAT ou de la lipogenèse in vitro. Ainsi, ces NCADSCs peuvent fournir un système précieux pour étudier les commutateurs moléculaires impliqués dans la différenciation PVAT.

Introduction

La prévalence de l’obésité augmente dans le monde entier, ce qui augmente le risque de maladies chroniques connexes, y compris les maladies cardiovasculaires et le diabète1. PVAT entoure les vaisseaux sanguins et est une source majeure de facteurs endocriniens et paracrines impliqués dans la fonction de la vascularisation. Les études cliniques montrent que la teneur élevée en PVAT est un facteur de risque indépendant de la maladie cardio-vasculaire2,3, et sa fonction pathologique dépend du phénotype des cellules souches dérivées de l’adipose constituante (ADSCs)4.

Bien que les lignées cellulaires DaDSC comme la murine 3T3-L1, 3T3-F442A, et OP9 soient des modèles cellulaires utiles pour étudier l’adipogenèse ou la lipogenèse5, les mécanismes de régulation de l’adipogenèse diffèrent entre les lignées cellulaires et les cellules primaires. Les ADSC dans la fraction de cellules vasculaires stromal (SVF) isolées directement des tissus adipeux et induites pour se différencier en adipocytes récapitulent probablement l’adipogenèse in vivo et la lipogenèse6. Cependant, la fragilité, la flottabilité et les variations de taille et d’immunophénotypes des ADSC rendent leur isolement direct difficile. En outre, les différentes procédures d’isolement peuvent également affecter de manière significative le phénotype et la capacité potentielle adipogénique de ces cellules7,soulignant ainsi la nécessité d’un protocole qui maintient l’intégrité d’ADSC.

Le tissu adipeux est typiquement classifié comme tissu d’adipeux blanc morphologiquement et fonctionnellement distinct (WAT), ou le tissu adipeux brun (BAT)8, qui abrite des ADSC distincts9. Tandis que les ADSC isolés des WATs sous-cutanés périgonadalets et inguinals ont été caractérisés dans les études précédentes9,10,11,12, moins est connu concernant les ADSC s’agit de PVAT qui est principalement composé de BAT13.

Dans une étude récente, nous avons constaté qu’une partie des ADSC résidents dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) sont dérivés des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules progénitrices migratoires qui proviennent de l’ectoderm14,15. Des souris transgéniques de Wnt1-Cre ont été employées pour tracer le développement neural de cellules de crête16,17. Nous avons traversé wnt1-Cre souris avec Rosa26RFP / souris pour générer Wnt-1 Cre– ; Rosa26RFP / Souris, dans lequel les CNC et leurs descendants sont étiquetés avec des protéines fluorescentes rouges (DP) et sont facilement suivis in vivo et in vitro15. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler la crête neurale dérivée aDSCs (NC-dérivé ADSCs, ou NCADSCs) de la souris PAAT et induire les NCADSCs pour se différencier en adipocytes blancs ou adipocytes bruns.

Protocol

Le protocole animal a été examiné et approuvé par le Comité des soins aux animaux de l’Université Jiao Tong de Shanghai. 1. Génération de Wnt-1 Cre-; Rosa26RFP / Souris Cross Wnt-1 Cre-/- souris16 avec Rosa26RFP/ souris 18 pour générer Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Maison des souris sous un cycle de lumière/obscurité de 12 h dans une installation exempte…

Representative Results

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons obtenu 0,5 à 1,0 x 106 ADSC de 5 à 6 Wnt-1Cre.-; Rosa26Souris De p. 100 (48 semaines, mâle ou femelle). Le diagramme d’écoulement de la collection de PAAT des souris est présenté dans la figure 1. La morphologie des NCADSCs était semblable à l’ADSC d’autres tissus adipeux de souris. Les NCADSC cultivés ont atteint 80 à 90 % de confluence après 7 à 8 jours de …

Discussion

Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique des NCADSC extraits du PVAT de Wnt-1Cre. Rosa26RFP / souris transgéniques conçues pour produire des PDSA. Les rapports précédents montrent qu’il n’y a pas de différence significative dans l’expression des marqueurs mésenchymal sénogènes (MSC) généraux dans les NCADSCets et non NCADSCs22, et que les NCADSCont ont un fort potentiel de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

National Key R-D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), et Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ont fourni les fonds pour cette étude .

Materials

4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

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Cite This Article
Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

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