神経紋の分離、培養、脂肪形成誘導、周食脂肪組織由来の脂肪由来幹細胞
Summary
Wnt-1 Cre+/-の周産脂肪組織から誘導された脂肪由来幹細胞 (NCAC) の神経堤の分離、培養、脂肪誘導のプロトコルを提示します。ローザ26RFP/+マウス。NCAdscは、インビトロで脂肪形成または脂肪形成をモデル化するためのACの簡単にアクセス可能なソースであることができます。
Abstract
血管を取り巻く脂肪組織の過剰な量(PVATとも呼ばれる血管周囲脂肪組織)は、心血管疾患のリスクが高いと関連している。異なる脂肪組織に由来するAVCは明確な特徴を示し、PVATからのAPCは十分に特徴付けされていなかった。最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)の一部のADCが、外虫に由来する一過性の移動細胞である神経堤細胞(NCCs)から下降することを報告した。
本稿では、Wnt-1 Cre+/-のPAATから赤蛍光タンパク質(RFP)標識NCCを分離するためのプロトコルについて説明する。Rosa26RFP/+マウスと体外でのそれらの二分化を誘導します。簡単に言うと、間質血管画分(SVF)はPAATから酵素的に解離され、RFP+神経堤由来AVC(NCADSC)は蛍光活性化細胞選別(FACS)によって単離される。NCADSCは、茶色と白の両方のアディポサイトに分化し、凍結保存することができ、〜3〜5節の間、その有数可能性を保持することができます。当社のプロトコルは、PVATの脂肪形成またはインビトロでの脂肪生成のモデル化のためにPVATから豊富なAdscを生成することができる。したがって、これらのNCADSCはPVAT分化に関与する分子スイッチを研究するための貴重なシステムを提供することができる。
Introduction
肥満の罹患率は世界的に増加しており、これは心血管疾患および糖尿病を含む関連慢性疾患のリスクを増大させる1.PVATは血管を取り囲み、血管系機能に関与する内分泌およびパラクリン因子の主要な供給源である。臨床研究は、高いPVAT含有量が心血管疾患2、3の独立した危険因子であり、その病理学的機能が構成脂肪由来幹細胞(AC)の表現型に依存することを示す4。
マウス3T3-L1、3T3-F442A、OP9などのADSC細胞株は、脂肪形成または脂肪形成5を研究するのに有用な細胞モデルであるが、脂肪形成のための調節機構は細胞株と一次細胞間で異なる。間質血管細胞画分(SVF)中のAVCは脂肪組織から直接分離し、生体内脂肪形成および脂肪形成6で再キャピテーションする可能性が最も高い脂肪細胞に分化するように誘導される。しかし、APCの脆弱性、浮力、およびサイズと免疫フェノタイプのバリエーションは、その直接的な分離を困難にします。さらに、異なる分離手順は、これらの細胞7の表現型および食前性電位能力にも大きな影響を及ぼし、したがってADSC完全性を維持するプロトコルの必要性を強調する。
脂肪組織は典型的には、形態学的および機能的に別個の白色脂肪組織(WAT)、または褐色脂肪組織(BAT)8のいずれかに分類され、これらは異なるACC9を収容する。皮下過性およびインギナル皮下WATから単離されたAVCは、以前の研究9、10、11、12で特徴付けられてきたが、BAT13を主成分とするPVATからのAVCに関してはあまり知られていない。
最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)に存在するADCの一部が神経堤細胞(NCCs)に由来することを発見した。Wnt1-Creトランスジェニックマウスは、神経堤細胞発生16、17をトレースするために使用した。私たちは、Wnt-1 Cre+/-を生成する Rosa26RFP/+マウスと Wnt1-Cre+マウスを交配しました。Rosa26RFP/+マウスは、NCCとその子孫が赤色蛍光タンパク質(RFP)で標識され、生体内およびインビトロ15で容易に追跡される。ここでは、マウスPAATから神経堤由来AVC(NC由来AVC、またはNCAC)を分離し、白色のアディポサイトまたは褐色のアディポサイトに分化するようにNCAdsCを誘導する方法について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、Wnt-1 Cre+/-のPVATから抽出されたNCACの分離、培養、および食化誘導のための信頼できる方法を提示する。RFP+ ADCを製造するように設計されたRosa26RFP/+トランスジェニックマウス。これまでの報告では、NCACおよび非NCAdsC2における一般的な多能性間葉系幹細胞(CS)マーカーの発現に有意差はなく、NCAdsCはビトロ15,22,23の中でジポサイトに分化す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国国家主要研究開発プログラム(2018YFC1312504)、中国自然科学財団(81970378、81670360、81870293)、上海市科学技術委員会(174119710000、17140902402)が提供した。.
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
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