Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von neuronalen Kamm abgeleiteten Adipose-abgeleiteten Stammzellen (NCADSCs) aus dem periaortischen Fettgewebe von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse. Die NCADSCs können eine leicht zugängliche Quelle von ADSCs zur Modellierung von Adipogenese oder Lipogenese in vitro sein.
Abstract
Eine übermäßige Menge an Fettgewebe, das die Blutgefäße umgibt (perivaskuläres Fettgewebe, auch bekannt als PVAT), ist mit einem hohen Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbunden. ADSCs, die aus verschiedenen Fettgeweben gewonnen wurden, weisen unterschiedliche Merkmale auf, und die von der PVAT sind nicht gut charakterisiert. In einer aktuellen Studie berichteten wir, dass einige ADSCs im periaortischen Bogenfettgewebe (PAAT) von den neuralen Kammzellen (NCCs) abstammen, einer vorübergehenden Population von Zugzellen, die aus dem Ektoderm stammen.
In diesem Beitrag beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von rotem fluoreszierendem Protein (RFP)-markierten NCCs aus dem PAAT von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse und induzieren ihre adipogene Differenzierung in vitro. Kurz gesagt, die stromale Gefäßfraktion (SVF) wird enzymatisch vom PAAT getrennt, und die rFP+ neuronalen Kamm abgeleiteten ADSCs (NCADSCs) werden durch fluoreszaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert. Die NCADSCs unterscheiden sich sowohl in braune als auch in weiße Adipozyten, können kryokonserviert werden und behalten ihr adipogenes Potenzial für 3–5 Passagen. Unser Protokoll kann reichlich ADSCs aus dem PVAT zur Modellierung der PVAT-Adipogenese oder Lipogenese in vitro generieren. Somit können diese NCADSCs ein wertvolles System zur Untersuchung der molekularen Schalter bieten, die an der PVAT-Differenzierung beteiligt sind.
Introduction
Die Prävalenz von Adipositas nimmt weltweit zu, was das Risiko für verwandte chronische Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes1erhöht. PVAT umgibt Blutgefäße und ist eine wichtige Quelle für endokrine und parakrine Faktoren, die an der Vaskulaturfunktion beteiligt sind. Klinische Studien zeigen, dass ein hoher PVAT-Gehalt ein unabhängiger Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungenist 2,3, und seine pathologische Funktion hängt vom Phänotyp der konstituierenden adipose-abgeleiteten Stammzellen (ADSCs)4ab.
Obwohl ADSC-Zelllinien wie die murinen 3T3-L1, 3T3-F442A und OP9 nützliche zelluläre Modelle sind, um Adipogenese oder Lipogenese5zu untersuchen, unterscheiden sich die regulatorischen Mechanismen für die Adipogenese zwischen Zelllinien und Primärzellen. Die ADSCs in der stromalen Vaskulären Zellfraktion (SVF) isoliert direkt aus Fettgewebeund und induziert, um in Adipozyten zu differenzieren höchstwahrscheinlich rekapitulieren in vivo Adipogenese und Lipogenese6. Die Fragilität, der Auftrieb und die Größenunterschiede und Immunphenotypen der ADSCs machen ihre direkte Isolation jedoch schwierig. Darüber hinaus können die verschiedenen Isolationsverfahren auch den Phänotyp und die adipogene Potenzialfähigkeit dieser Zellen7erheblich beeinflussen, wodurch die Notwendigkeit eines Protokolls betont wird, das die ADSC-Integrität beibehält.
Adipose-Gewebe wird in der Regel entweder als das morphologisch und funktionell ausgeprägte weiße Fettgewebe (WAT) oder das braune Fettgewebe (BAT)8klassifiziert, das unterschiedliche ADSCs9beherbergt. Während ADSCs, die aus perigonadalen und leistensubkutanen WATs isoliert sind, in früheren Studien9,10,11,12gekennzeichnet wurden, ist weniger in Bezug auf die ADSCs aus PVAT bekannt, die hauptsächlich aus BAT13bestehen.
In einer aktuellen Studie fanden wir heraus, dass ein Teil der gebietsansässigen ADSCs im periaortischen Arch-Fettgewebe (PAAT) aus neuronalen Kammzellen (NCCs) abgeleitet wird, einer vorübergehenden Population von wandernden Vorläuferzellen, die aus dem Ektoderm14,15stammen. Wnt1-Cre transgene Mäuse wurden zur Verfolgung der Entwicklung von neuronalen Kammzellen16,17verwendet. Wir kreuzten Wnt1-Cre+ Mäuse mit Rosa26RFP/+ Mäusen, um Wnt-1 Cre+/-zu erzeugen; Rosa26RFP/+ Mäuse, bei denen NCCs und ihre Nachkommen mit rotem fluoreszierendem Protein (RFP) gekennzeichnet sind und leicht in vivo und in vitro15nachverfolgt werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von neuronalen Kamm abgeleiteten ADSCs (NC-abgeleitete ADSCs oder NCADSCs) von Maus-PAAT und induzieren die NCADSCs, sich in weiße Adipozyten oder braune Adipozyten zu differenzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie stellen wir eine zuverlässige Methode für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von NCADSCs dar, die aus dem PVAT von Wnt-1 Cre+/-extrahiert wurden. Rosa26RFP/+ transgene Mäuse zur Herstellung von RFP+ ADSCs. Frühere Berichte zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von allgemeinen multipotenten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) Markern in NCADSCs und Nicht-NCADSCs22gibt und dass NCADSCs ein starkes Potenzial h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) und Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) stellten die Mittel für diese Studie zur Verfügung. .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
