العزلة والثقافة وتحريض Adipogenic من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية العصبية من الأنسجة الدهنية
Summary
نقدم بروتوكولا ً للعزل والثقافة والحث الإديفيوجيني للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية المحيطية لـ Wnt-1 Cre+/-؛ Rosa26RFP/ + الفئران. يمكن أن تكون NCADSCs مصدرًا يمكن الوصول إليه بسهولة من ADSCs لنمذجة الأديبوجينيسيس أو تكوين الدهون في المختبر.
Abstract
ترتبط الكمية المفرطة من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية، والمعروفة أيضًا باسم PVAT) بارتفاع خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية. تظهر ADSCs المشتقة من الأنسجة الدهنية المختلفة ميزات متميزة ، ولم يتم توصيف تلك الموجودة في PVAT بشكل جيد. في دراسة حديثة، أبلغنا أن بعض ADSCs في الأنسجة الدهنية القوس المحيطي (PAAT) تنحدر من خلايا القمة العصبية (NCCs)، وهي مجموعة عابرة من الخلايا المهاجرة الناشئة من الخلايا الجذعية.
في هذه الورقة، نصف بروتوكول لعزل البروتين الفلوري الأحمر (RFP) المسمى NCCs من PAAT من Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP / + الفئران وحفز التمايز adipogenic في المختبر. باختصار ، يتم فصل كسر الأوعية الدموية المترفية (SVF) بشكل أنزيمي عن PAAT ، ويتم عزل RFP+ قمة العصبية المشتقة ADSCs (NCADSCs) عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). وNCADSCs تفرق إلى كل من الخلايا الشحمية البني والأبيض، يمكن cryopreserved، والاحتفاظ إمكاناتها adipogenic ل ~ 3-5 الممرات. يمكن أن يولد بروتوكولنا ADSCs وفيرة من PVAT لنمذجة الخلايا الدهنية PVAT أو lipogenesis في المختبر. وهكذا، يمكن لهذه NCADSCs توفير نظام قيمة لدراسة مفاتيح الجزيئية المشاركة في التمايز PVAT.
Introduction
انتشار السمنة في تزايد في جميع أنحاء العالم، مما يزيد من خطر الأمراض المزمنة ذات الصلة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية ومرض السكري1. PVAT تحيط الأوعية الدموية وهو مصدر رئيسي لعوامل الغدد الصماء والباراكرين المشاركة في وظيفة الأوعية الدموية. تظهر الدراسات السريرية أن نسبة PVAT العالية هي عامل خطر مستقل لأمراض القلب والأوعية الدموية2،3، وتعتمد وظيفتها المرضية على النمط الظاهري للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية المكونة (ADSCs)4.
على الرغم من أن خطوط الخلايا ADSC مثل murine 3T3-L1, 3T3-F442A, وOP9 هي نماذج خلوية مفيدة لدراسة adipogenesis أو lipogenesis5,الآليات التنظيمية لadipogenesis تختلف بين خطوط الخلية والخلايا الأولية. وADSCs في كسر الخلية الوعائية سترومال (SVF) معزولة مباشرة من الأنسجة الدهنية والناجمة عن التفريق في الخلايا الدهنية على الأرجح خلاصة في الجسم الحي adipogenesis وlipogenesis6. ومع ذلك ، فإن هشاشة وطفو هاوية واختلافات في الحجم والأنماط المناعية للأنظمة المحاسبية الدولية للأنظمة تجعل عزلتها المباشرة صعبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر إجراءات العزل المختلفة أيضًا بشكل كبير على النمط الظاهري والقدرة المحتملة الأيديجينية لهذه الخلايا7، مما يؤكد على الحاجة إلى بروتوكول يحافظ على سلامة ADSC.
عادة ما تصنف الأنسجة الدهنية إما الأنسجة الدهنية البيضاء متميزة شكليا ووظيفيا (وات)، أو الأنسجة الدهنية البني (BAT)8، الذي يؤوي ADSCsمتميزة 9. في حين أن ADSCs معزولة عن perigonadal والغناء تحت الجلد WATs وقد تميزت في الدراسات السابقة9،10،11،12، أقل من المعروف فيما يتعلق ADSCs من PVAT التي تتألف أساسا من BAT13.
في دراسة حديثة ، وجدنا أن جزءًا من ADSCs المقيم في الأنسجة الدهنية للقوس المحيطي (PAAT) مشتقة من خلايا القمة العصبية (NCCs) ، وهي مجموعة سكانية عابرة من خلايا السلف المهاجرة التي تنشأ من ectoderm14،15. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا Wnt1-Cre لتتبع تطور الخلايا العصبية كريست16،17. عبرنا Wnt1-Cre+ الفئران مع روزا26RFP / + الفئران لتوليد Wnt-1 كري+/-؛ روزا26RFP / + الفئران، التي يتم تسمية NCCs وذريتها مع البروتين الفلوري الأحمر (RFP) ويتم تعقبها بسهولة في vivo وفي المختبر15. هنا، ونحن نصف طريقة لعزل قمة العصبية المستمدة ADSCs (NC المشتقة ADSCs، أو NCADSCs) من PAAT الماوس وحث NCADSCs للتمييز إلى الخلايا الشحمية البيضاء أو الخلايا الشحمية البني.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، نقدم طريقة موثوقة لعزل، والثقافة، والحث adipogenic من NCADSCs المستخرجة من PVAT من Wnt-1 كري+/-؛ روزا26RFP / + الفئران المعدلة وراثيا مصممة لإنتاج RFP+ ADSCs. تظهر التقارير السابقة أنه لا يوجد فرق كبير في التعبير عن الخلايا الجذعية المتوسطة المتعددة القدرات العامة (MSCs) في NCADSCs و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
قدم البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2018YFC1312504)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970378، 81670360، 81870293)، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (17411971000، 17140902402) الأموال اللازمة لهذه الدراسة .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
