Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico
Summary
Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.
Abstract
Uma quantidade excessiva de tecido adiposo ao redor dos vasos sanguíneos (tecido adiposo perivascular, também conhecido como PVAT) está associada a um alto risco de doenças cardiovasculares. Os ADSCs derivados de diferentes tecidos adiposos apresentam características distintas, e os do PVAT não foram bem caracterizados. Em um estudo recente, relatamos que alguns ADSCs no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) descendem das células da crista neural (NCCs), uma população passageira de células migratórias originárias do ectoderm.
Neste artigo, descrevemos um protocolo para isolar AS NCCs vermelhas fluorescentes (RFP) rotuladas pelo PAAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos e indução de sua diferenciação adipogênica in vitro. Resumidamente, a fração vascular estromal (SVF) é enzimáticamente dissociada do PAAT, e os ADSCs derivados da crista neural RFP+ neural (NCADSCs) são isolados pela classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Os NCADSCs se diferenciam tanto em adipócitos marrons quanto brancos, podem ser crioreservadoss e manter seu potencial adipogênico para ~3-5 passagens. Nosso protocolo pode gerar ADSCs abundantes a partir do PVAT para modelar adipogênese PVAT ou lipogênese in vitro. Assim, esses NCADSCs podem fornecer um sistema valioso para estudar os interruptores moleculares envolvidos na diferenciação de PVAT.
Introduction
A prevalência de obesidade está aumentando em todo o mundo, o que aumenta o risco de doenças crônicas relacionadas, incluindo doenças cardiovasculares e diabetes1. PvAT envolve vasos sanguíneos e é uma das principais fontes de fatores endócrinos e paracrinos envolvidos na função vasculatura. Estudos clínicos mostram que o alto teor de PVAT é um fator de risco independente de doenças cardiovasculares2,3, e sua função patológica depende do fenótipo das células-tronco derivadas de adiposos constituintes (ADSCs)4.
Embora linhas celulares ADSC como a murina 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sejam modelos celulares úteis para estudar adipogênese ou lipogênese5,os mecanismos regulatórios para adipogênese diferem entre linhas celulares e células primárias. Os ADSCs na fração de célulavascular estrônita (SVF) isolaram-se diretamente dos tecidos adippose e induzidos a diferenciar em adipócitos provavelmente recapitulando na adipogênese vivo e lipogênese6. No entanto, a fragilidade, a flutuação e as variações de tamanho e imunofenótipos dos ADSCs tornam seu isolamento direto desafiador. Além disso, os diferentes procedimentos de isolamento também podem afetar significativamente a capacidade potencial fenótipo e adipogênica dessas células7,enfatizando assim a necessidade de um protocolo que mantenha a integridade do ADSC.
O tecido adiposo é tipicamente classificado como o tecido adiposo branco morfologicamente e funcionalmente distinto (WAT), ou o tecido adiposo marrom (BAT)8, que abriga ADSCs distintos9. Embora as ADSCs isoladas de WATs subcutâneos e subcutâneos foram caracterizadas em estudos anteriores9,10,11,12, menos se sabe em relação aos ADSCs da PVAT que é composto principalmente por BAT13.
Em um estudo recente, descobrimos que uma parte dos ADSCs residentes no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) são derivados de células de crista neural (NCCs), uma população transitória de células progenitoras migratórias que se originam do ectoderm14,15. Os camundongos transgênicos Wnt1-Cre foram usados para rastrear o desenvolvimento de células de crista neural16,17. Cruzamos os mouses Wnt1-Cre+ com ratos Rosa26RFP/+ para gerar O Cre Wnt-1+/-; Os camundongos Rosa26RFP/+, nos quais as NCCs e seus descendentes são rotulados com proteína fluorescente vermelha (RFP) e são facilmente rastreados in vivo e in vitro15. Aqui, descrevemos um método para isolar adsCs derivados da crista neural (ADSCs derivados de NC, ou NCADSCs) do PAAT do mouse e induzir os NCADSCs a diferenciar em adipócitos brancos ou adipócitos marrons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, apresentamos um método confiável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de NCADSCs extraídos do PVAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos transgênicos projetados para produzir RFP+ ADSCs. Relatórios anteriores mostram que não há diferença significativa na expressão de marcadores de células-tronco mesenquinais multipotentes gerais (MSCs) em NCADSCs e não NCADSCs22, e que os NCADSCs têm um forte potencial para diferenciar em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1312504), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81970378, 81670360, 81870293) e Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (17411971000, 17140902402) forneceram os fundos para este estudo .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
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