AMEBaS: Polarize Tek Hücrelerin Oransal Floresan Zaman Atlamalarının Otomatik Orta Hat Ekstraksiyonu ve Arka Plan Çıkarımı
概要
Polarize tek hücrelerin hücre içi dinamiklerini analiz etmek için mevcut yöntemler genellikle manueldir ve standardizasyondan yoksundur. Bu makale, tek polarize hücrelerin orta hat ekstraksiyonunu otomatikleştirmek ve kullanıcı dostu bir çevrimiçi arayüzde zaman atlamalarından uzay-zamansal davranışı ölçmek için yeni bir görüntü analizi boru hattı sunmaktadır.
Abstract
Hücre polaritesi, hücre altı düzeyde özel alanların ortaya çıkmasıyla sonuçlanan, uzamsal olarak konsantre moleküller ve yapılar topluluğu tarafından kurulan makroskopik bir fenomendir. Hücre bölünmesi, büyümesi ve göçü gibi temel biyolojik işlevlerin altında yatan asimetrik morfolojik yapıların geliştirilmesiyle ilişkilidir. Ek olarak, hücre polaritesinin bozulması, kanser ve mide displazisi gibi doku ile ilgili bozukluklarla ilişkilendirilmiştir.
Bireysel polarize hücrelerde floresan raportörlerin uzay-zamansal dinamiklerini değerlendirmek için mevcut yöntemler, genellikle hücrelerin ana ekseni boyunca bir orta hattı izlemek için manuel adımlar içerir, bu da zaman alıcıdır ve güçlü önyargılara eğilimlidir. Ayrıca, oransal analiz, iki floresan kanalı kullanarak raportör moleküllerin eşit olmayan dağılımını düzeltebilse de, arka plan çıkarma teknikleri genellikle keyfidir ve istatistiksel destekten yoksundur.
Bu makale, bir hücre polaritesi modeli kullanarak tek hücrelerin uzay-zamansal davranışını otomatikleştirmek ve ölçmek için yeni bir hesaplama hattı sunmaktadır: polen tüpü/kök kılı büyümesi ve sitozolik iyon dinamikleri. Oransal görüntüleri işlemek ve hücre içi dinamiklerin ve büyümenin nicel bir temsilini çıkarmak için üç aşamalı bir algoritma geliştirildi. İlk adım, hücreyi arka plandan bölümlere ayırır ve piksel yoğunluğu uzayında bir eşikleme tekniği aracılığıyla ikili bir maske üretir. İkinci adım, bir iskeletleştirme işlemi yoluyla hücrenin orta hattından geçen bir yolu izler. Son olarak, üçüncü adım, işlenen verileri bir oransal zaman atlamalı olarak sağlar ve bir oransal kimograf (yani, zaman içinde bir 1B uzamsal profil) verir. Büyüyen polen tüplerinden genetik olarak kodlanmış floresan raportörlerle elde edilen oransal görüntülerden elde edilen veriler, yöntemi karşılaştırmak için kullanıldı. Bu boru hattı, polarize hücrelerin orta hattı boyunca uzay-zamansal dinamiklerin daha hızlı, daha az önyargılı ve daha doğru bir şekilde temsil edilmesini sağlar, böylece hücre polaritesini araştırmak için mevcut nicel araç setini geliştirir. AMEBaS Python kaynak kodu şu adreste mevcuttur: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
Hücre polaritesi, uzamsal olarak konsantre moleküller ve yapılardan oluşan bir koleksiyonun uyumlu eyleminin, özel morfolojik hücre altı alanlarınkurulmasıyla sonuçlandığı temel bir biyolojik süreçtir 1. Hücre bölünmesi, büyümesi ve göçü bu tür polarite bölgelerine dayanırken, kaybı epitel doku ile ilgili bozukluklarda kanserle ilişkilendirilmiştir2.
Apikal olarak büyüyen hücreler, uçtaki polarite bölgesinin tipik olarak hücre dışı ipuçlarına yeniden yöneldiğidramatik bir polarite örneğidir 3. Bunlar, çoklu hücresel süreçlerin hücrenin ucundan sapa doğru belirgin farklılıklar gösterdiği nöritler, mantar hifleri, kök kılları ve polen tüplerinin geliştirilmesini içerir. Polen tüplerinde, özellikle, aktin polimerizasyonu, vezikül kaçakçılığı ve iyonik konsantrasyonlar, uç odaklıgradyanlar 4 göstererek belirgin şekilde polarize olur. Polen tüpleri, çiçekli bitkilerin erkek gametofitleridir ve tek bir hücre için bilinen en hızlı büyüme oranlarından birinde yalnızca hücrenin tepesinde büyüyerek sperm hücrelerini ovüle iletmekten sorumludur. Kalsiyum 5 (Ca2+) ve protonlar 6 (H+) gibi iyonların uç odaklı gradyanları, çift döllenme 5,6 ile sonuçlanan ana biyolojik işlevini yerine getirmek için gerekli olan polen tüpü büyümesinin sürdürülmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, apikal olarak büyüyen hücrelerin orta hattı boyunca uzay-zamansal dinamikleri analiz etmek için kantitatif yöntemler, polarize büyümenin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için gereklidir 7,8,9. Araştırmacılar genellikle kimografileri, yani hücrenin orta hattının (örneğin sütunlar) zaman içinde (örneğin satırlar) piksel yoğunluklarını temsil eden ve diyagonalde hücre büyümesini ve göçünü görselleştirmeye izin veren bir matris kullanırlar (Şekil 1). Kullanışlılıklarına rağmen, kimografiler sıklıkla orta hattı manuel olarak izleyerek çıkarılır, önyargılara ve insan hatalarına eğilimlidir ve aynı zamanda oldukça zahmetlidir. Bu, burada tanıtılan AMEBaS adlı boru hattının ilk özelliği olan otomatik bir orta hat ekstraksiyon yöntemini gerektirir: Polarizetek hücrelerin oransal floresan zaman atlamalarının utomatik bir Midline Extraction ve Background Sgeri çekilmesi.
Deneysel prosedürler açısından, tek hücrelerde ilgilenilen iyonların/moleküllerin/türlerin kantitatif görüntülenmesi, genetik olarak kodlanmış floresan problar10 ile elde edilebilir. Sürekli genişleyen seçenekler arasında, oransal problar, ilgilenilen moleküllere bağlı/bağlanmamış olduklarında farklı floresan dalga boyları yaydıkları için en doğru olanlardan biridir11. Bu, probun hücre içi konsantrasyonundaki uzamsal heterojenliğin, kanala özgü arka planları çıkarılmış iki kanalın oranını kullanarak düzeltilmesine izin verir. Bununla birlikte, her kanal ve zaman noktası için arka plan eşiğini tahmin etmek karmaşık bir görev olabilir, çünkü görüntünün köşelerinin merkeze göre parlaklık değişimine sahip olduğu gölgeleme gibi efektler nedeniyle ve floroforun solması (foto ağartma) nedeniyle zaman içinde genellikle uzayda değişir12. Birden fazla olası yöntem olmasına rağmen, bu makale, Isodata algoritması13 ile elde edilen segmentasyon eşiğini kullanarak arka plan yoğunluğunun otomatik olarak belirlenmesini önermektedir ve bu daha sonra standart olarak polinom regresyon yoluyla çerçeveler arasında yumuşatılmaktadır. Bununla birlikte,12’de çıkarılan hedef hücre ile ilgisi olmayan floresan heterojenliğinden kaynaklanan uzamsal bileşenler bu yöntemle göz ardı edildi. Otomatik eşikleme birkaç yöntemle gerçekleştirilebilir, ancak Isodata algoritması ampirik olarak en iyi sonuçları verdi. Bu nedenle, otomatik arka plan değeri çıkarma ve oransal hesaplama, birlikte ele alındığında, çift kanallı floresan mikroskobu görüntülerinin bir yığınını girdi olarak alan, hücrenin orta hattını ve kanala özgü arka planı tahmin eden ve arka plan çıkarma, yumuşatma ve aykırı değer kaldırma işleminden sonra her iki kanalın ve oranlarının (ana çıkış #1) kymograflarını çıkaran AMEBaS’ın (Şekil 1) ikinci ana özelliğidir. bir yığın ratiometrik görüntü ile birlikte (ana çıktı #2).
AMEBaS, polene özgü LAT52 promotörü altında eksprese edilen Ca2+ (CaMeleon)8 veya pH (pHluorin)6 oranlı sensörler ile mikroskop altında elde edilen büyüyen Arabidopsis polen tüplerinin floresan zaman atlamaları ile test edildi. Her kanaldan alınan görüntüler, ters çevrilmiş bir mikroskop, önden aydınlatmalı bir kamera (2560 piksel × 2160 piksel, piksel boyutu 6.45 μm), bir floresan aydınlatıcı ve 63x, 1.2NA suya daldırma objektif lensi ile birlikte her 4 saniyede bir çekildi. CaMeleon için kullanılan filtre ayarları şunlardı: uyarma 426-450 nm (CFP) ve 505-515 nm (YFP), emisyon 458-487 nm (CFP) ve 520-550 nm (YFP), pHluorin için uyarma 318-390 nm (DAPI) ve 428-475 nm (FITC), emisyon 435-448 nm (DAPI) ve 523-536 nm (FITC). Zenodo’da test için eksiksiz bir veri seti eklendi (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
Ek olarak, boru hattı, daha önce tarif edildiği gibi bir ışık tabakası mikroskobu (SPIM) ile görüntülemenin yapıldığı kök kıl verileriyle test edildi 15,16 UBQ10 promotörü 17’nin kontrolü altında genetik olarak kodlanmış Ca 2+ raportör NES-YC3.6’yı eksprese eden Arabidopsiskök kılları ile. Işık tabakası mikroskobunun kamera alımını, örnek çevirisini ve deklanşörünü kontrol eden ev yapımı LabView yazılımı, iki cpVenus ve CFP kanalının gözlemlenmesine ve aynı zamanda oranlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi. Hızlandırılmış çekimin her oran görüntüsü, 3 μm aralıklı numunenin 15 diliminden elde edilen cpVenus ve CFP floresan kanalları görüntüleri arasında bir maksimum yoğunluk projeksiyonunu (MIP) temsil ediyordu. MIP’lerin hızlandırılmış cpVenüs/CFP oranı kaydedildi ve doğrudan AMEBaS analizi için kullanıldı.
Bu boru hattı, birden fazla büyüyen ve göç eden hücre türüyle çalışabilmesine rağmen, çerçeveler arasında büyümeyen sitoplazmik bölgelerin bir yazışmasının olduğu polen tüpleri, kök kılları ve mantar hifleri gibi yalnızca uçta büyüyen büyüyen hücreleri analiz etmek için özel olarak tasarlanmıştır. Böyle bir yazışma olmadığında, kullanıcı adım 1.3.1.1’deki complete_skeletonization seçeneğini seçmelidir (daha fazla ayrıntı için Tartışma bölümüne bakın).
Şekil 1: İşlem hattı iş akışına genel bakış. AMEBaS boru hattı, mikroskobik zaman atlamalarını üç ana adımda analiz eder ve işler: Tek Hücreli Segmentasyon, Orta Hat İzleme ve Kymograph Oluşturma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yeni yöntem, polarize hücrelerin floresan mikroskobu görüntü yığınlarının analizini kolaylaştırmak ve otomatikleştirmek için güçlü bir araçtır. ImageJ Kymograph eklentileri gibi literatürde açıklanan mevcut yöntemler, ilgilenilen polarize hücrenin orta hattının manuel olarak izlenmesini gerektirir, bu sadece zaman alıcı değil, aynı zamanda insan hatalarına da eğilimli bir görevdir. Bu boru hattındaki orta hattın tanımı, iskeletleştirmeyi gerçekleştiren sayısal bir y…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, FAPESP hibeleri 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 hibe GM131043 ve NSF hibeleri MCB1714993, MCB1930165 mali destek için minnettardır. Kök saç verileri Prof. Andrea Bassi ve Prof. Alex Costa’nın süpervizörlüğünde ve altyapısında üretildi.
Materials
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
参考文献
- Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. . The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. . Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -. C., Kashyap, R. L., Chu, C. -. N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
