AMEBaS: Автоматическое выделение срединной линии и вычитание фона ратиометрических флуоресцентных таймлапсов поляризованных одиночных ячеек

Полярность клеток является фундаментальным биологическим процессом, в котором согласованное действие набора пространственно концентрированных молекул и структур достигает кульминации в создании специализированных морфологических субклеточных^{доменов.} Деление, рост и миграция клеток зависят от таких участков полярности, в то время как их потеря связана с раком при заболеваниях, связанных с эпителиальной тканью².

Апикально растущие клетки являются ярким примером полярности, когда участок полярности на кончике обычно переориентируется на внеклеточные сигналы³. К ним относятся развивающиеся невриты, грибковые гифы, корневые волоски и пыльцевые трубки, где множественные клеточные процессы демонстрируют выраженные различия от кончика клетки к ножке. В пыльцевых трубках, в частности, полимеризация актина, транспорт везикул и концентрация ионов заметно поляризуются, демонстрируя градиенты, сфокусированные на кончиках⁴. Пыльцевые трубки являются мужскими гаметофитами цветковых растений и отвечают за доставку сперматозоидов к яйцеклетке, растя исключительно на верхушке клетки с одной из самых быстрых скоростей роста, известных для одной клетки. Градиенты ионов, таких как кальций 5 (Ca²+) и протоны 6 (H⁺), играют важную роль в поддержании роста пыльцевой трубки, что необходимо для выполнения ее основной биологической функции, кульминацией которой является двойное оплодотворение ^5,6. Таким образом, количественные методы анализа пространственно-временной динамики вдоль срединной линии апикально растущих клеток имеют важное значение для изучения клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе поляризованного роста ^7,8,9. Исследователи часто используют кимографы, т.е. матрицы, представляющие интенсивность пикселей средней линии клетки (например, столбцов) во времени (например, строк), что позволяет визуализировать рост и миграцию клеток по диагонали (рис. 1). Несмотря на свою полезность, кимографы часто извлекаются путем ручного отслеживания средней линии, что подвержено предвзятости и человеческим ошибкам, а также довольно трудоемко. Это требует автоматизированного метода выделения срединной линии, который является первой особенностью представленного здесь конвейера под названием AMEBaS: Automatic Midline Extraction and Background Sутракции ратиометрической флуоресценции поляризованных одиночных клеток.

С точки зрения экспериментальных процедур, количественная визуализация интересующих ионов/молекул/видов в отдельных клетках может быть достигнута с помощью генетически кодируемых флуоресцентных зондов¹⁰. Среди постоянно расширяющегося выбора ратиометрические зонды являются одними из самых точных, поскольку они излучают различные длины волн флуоресценции при связывании/развязывании^{с интересующими} молекулами. Это позволяет корректировать пространственную неоднородность внутриклеточной концентрации зонда за счет соотношения двух каналов с вычитанием их канального специфического фона. Однако оценка фонового порога для каждого канала и точки времени может быть сложной задачей, поскольку он часто изменяется в пространстве из-за таких эффектов, как затенение, когда углы изображения имеют изменение яркости относительно центра, и во времени из-за затухания флуорофора (фотообесцвечивание)¹². Несмотря на то, что существует множество возможных методов, в данной работе предлагается определять интенсивность фона автоматически, используя порог сегментации, полученный с помощью алгоритма Isodata¹³, который затем сглаживается по кадрам с помощью полиномиальной регрессии в качестве стандарта. Однако пространственные компоненты, проистекающие из флуоресцентной гетерогенности, не связанной с клеткой-мишенью, удаленной в¹², были проигнорированы этим методом. Автоматическое пороговое определение может быть выполнено несколькими методами, но алгоритм Isodata дал наилучшие результаты эмпирически. Таким образом, автоматическое вычитание значения фона и ратиометрический расчет являются второй основной особенностью AMEBaS (рис. 1), которая в совокупности получает на вход стопку изображений двухканальной флуоресцентной микроскопии, оценивает срединную линию ячейки и канальный фон, а также выдает кимографы обоих каналов и их соотношение (основной выход #1) после вычитания фона, сглаживания и удаления выбросов. вместе со стопкой ратиометрических изображений (основной выход #2).

AMEBaS был протестирован с помощью флуоресцентных таймлапсов растущих пыльцевых трубок Arabidopsis, полученных под микроскопом, либо с помощью ратиометрических сенсоров Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ или pH (pHluorin)⁶ , экспрессированных под пыльцевым промотором LAT52. Изображения с каждого канала делались каждые 4 с в сочетании с инвертированным микроскопом, камерой с фронтальной подсветкой (2560 пикселей × 2160 пикселей, размер пикселя 6,45 мкм), флуоресцентным осветителем и объективом с погружением в воду 63x, 1,2NA. Для CaMeleon использовались следующие настройки фильтров: возбуждение 426-450 нм (CFP) и 505-515 нм (YFP), излучение 458-487 нм (CFP) и 520-550 нм (YFP), в то время как для pHluorin возбуждение 318-390 нм (DAPI) и 428-475 нм (FITC), излучение 435-448 нм (DAPI) и 523-536 нм (FITC). Для тестирования в Zenodo был добавлен полный набор данных (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Кроме того, трубопровод был протестирован с данными корневых волосков, где визуализация была выполнена с помощью светового листового микроскопа (SPIM), как описано ранее^15,16, с корневыми волосками арабидопсиса^, экспрессирующими генетически кодируемый^Ca2+ репортер NES-YC3.6 под контролем промотора UBQ10 ¹⁷. Самодельное программное обеспечение LabView, которое управляло захватом камеры, перемещением образца и затвором светового микроскопа, позволяло наблюдать два канала cpVenus и CFP, а также визуализировать их соотношение в режиме реального времени. Каждое изображение интервальной съемки представляло собой проекцию максимальной интенсивности (MIP) между изображениями флуоресцентных каналов cpVenus и CFP, полученными из 15 срезов образца, расположенных на расстоянии 3 мкм друг от друга. Интервальная съемка соотношения cpVenus/CFP MIP была сохранена и непосредственно использована для анализа AMEBaS.

Хотя этот конвейер может работать с несколькими типами растущих и мигрирующих клеток, он был специально разработан для анализа растущих клеток, которые растут исключительно на кончике, таких как пыльцевые трубки, корневые волоски и гифы грибов, где существует соответствие нерастущих цитоплазматических областей между рамками. Если такого соответствия нет, пользователь должен выбрать вариант complete_skeletonization на шаге 1.3.1.1 (подробнее см. раздел Обсуждение).

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса конвейера. Конвейер AMEBaS анализирует и обрабатывает микроскопические таймлапсы в три основных этапа: сегментация отдельных клеток, трассировка срединных линий и генерация кимографа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.