AMEBaS: Automatische middellijnextractie en achtergrondaftrekking van ratiometrische fluorescentie-time-lapses van gepolariseerde afzonderlijke cellen

Celpolariteit is een fundamenteel biologisch proces waarbij de gecoördineerde actie van een verzameling ruimtelijk geconcentreerde moleculen en structuren culmineert in de oprichting van gespecialiseerde morfologische subcellulaire domeinen¹. Celdeling, groei en migratie zijn afhankelijk van dergelijke polariteitsplaatsen, terwijl het verlies ervan in verband is gebracht met kanker bij epitheelweefselgerelateerde aandoeningen².

Apicaal groeiende cellen zijn een dramatisch voorbeeld van polariteit, waarbij de polariteitsplaats aan het uiteinde zich typisch heroriënteert op extracellulaire signalen³. Deze omvatten het ontwikkelen van neurieten, schimmeldraden, wortelharen en stuifmeelbuizen, waar meerdere cellulaire processen uitgesproken verschillen vertonen van de punt van de cel naar de schacht. Met name in stuifmeelbuizen zijn actinepolymerisatie, blaasjesverkeer en ionische concentraties duidelijk gepolariseerd, met tipgerichte gradiënten⁴. Stuifmeelbuizen zijn de mannelijke gametofyten van bloeiende planten en zijn verantwoordelijk voor het afleveren van de zaadcellen aan de zaadknop door uitsluitend aan de top van de cel te groeien met een van de snelste groeisnelheden die bekend zijn voor een enkele cel. De tipgerichte gradiënten van ionen zoals calcium 5 (Ca²+) en protonen 6 (H⁺) spelen een belangrijke rol bij het in stand houden van de groei van stuifmeelbuizen, wat essentieel is om de belangrijkste biologische functie te vervullen die culmineert in een dubbele bevruchting ^5,6. Kwantitatieve methoden om de spatiotemporele dynamiek langs de middellijn van apicaal groeiende cellen te analyseren, zijn dus essentieel om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan gepolariseerde groei ^7,8,9. Onderzoekers gebruiken vaak kymografen, d.w.z. een matrix die de pixelintensiteiten van de middellijn van de cel (bijv. kolommen) door de tijd heen weergeeft (bijv. rijen), waardoor celgroei en -migratie diagonaal kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1). Ondanks hun nut worden kymografen vaak geëxtraheerd door de middellijn handmatig te traceren, omdat ze vatbaar zijn voor vooroordelen en menselijke fouten, terwijl ze ook nogal omslachtig zijn. Dit vraagt om een geautomatiseerde methode van middellijnextractie die het eerste kenmerk is van de pijplijn die hierin wordt geïntroduceerd, AMEBaS genaamd: eenutomatische M-idline E-xtractiejp Background S-ubtractievan ratiometrische fluorescentie-time-lapses van gepolariseerde afzonderlijke cellen.

In termen van experimentele procedures kan kwantitatieve beeldvorming van ionen/moleculen/soorten van belang in afzonderlijke cellen worden bereikt met genetisch gecodeerde fluorescerende sondes¹⁰. Van de steeds groter wordende keuzes zijn ratiometrische sondes een van de meest nauwkeurige, omdat ze verschillende fluorescentiegolflengten uitzenden wanneer ze gebonden/ongebonden zijn aan de moleculen van belang¹¹. Dit maakt het mogelijk om de ruimtelijke heterogeniteit in de intracellulaire concentratie van de sonde te corrigeren door gebruik te maken van de verhouding van twee kanalen met hun kanaalspecifieke achtergrond afgetrokken. Het schatten van de achtergronddrempel voor elk kanaal en tijdstip kan echter een complexe taak zijn, omdat deze vaak varieert in de ruimte als gevolg van effecten zoals schaduwen, waarbij de hoeken van het beeld helderheidsvariatie vertonen ten opzichte van het midden, en in de tijd als gevolg van vervaging van de fluorofoor (fotobleken)¹². Hoewel er meerdere mogelijke methoden zijn, stelt dit manuscript voor om de achtergrondintensiteit automatisch te bepalen met behulp van de segmentatiedrempel die is verkregen met het Isodata-algoritme¹³, die vervolgens standaard over frames wordt gladgestreken door middel van polynomiale regressie. Ruimtelijke componenten die voortkomen uit fluorescentieheterogeniteit die geen verband houden met de doelcel die in¹² werd verwijderd, werden echter door deze methode genegeerd. Automatische drempelwaarden kunnen op verschillende manieren worden uitgevoerd, maar het Isodata-algoritme leverde empirisch de beste resultaten op. Het automatisch aftrekken van de achtergrondwaarde en de berekening van de ratiometrie zijn dus het tweede hoofdkenmerk van AMEBaS (Figuur 1), dat samen een stapel tweekanaals fluorescentiemicroscopiebeelden als invoer ontvangt, de middellijn van de cel en de kanaalspecifieke achtergrond schat, en kymografen van beide kanalen en hun verhouding (hoofduitgang #1) uitvoert na achtergrondaftrekking, afvlakking en verwijdering van uitschieters, samen met een stapel ratiometrische afbeeldingen (hoofduitgang #2).

AMEBaS werd getest met fluorescentie-time-lapses van groeiende Arabidopsis-pollenbuizen verkregen onder een microscoop, hetzij met Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ of pH (pHluorin)⁶ ratiometrische sensoren uitgedrukt onder de pollenspecifieke LAT52-promotor. Beelden van elk kanaal werden elke 4 s gemaakt in combinatie met een omgekeerde microscoop, een camera met verlichting aan de voorkant (2560 pixels × 2160 pixels, pixelgrootte 6,45 μm), een fluorescentieverlichting en een objectieflens voor wateronderdompeling 63x, 1,2NA. Filterinstellingen die voor CaMeleon werden gebruikt, waren: excitatie 426-450 nm (CFP) en 505-515 nm (YFP), emissie 458-487 nm (CFP) en 520-550 nm (YFP), terwijl voor pHluorin, excitatie 318-390 nm (DAPI) en 428-475 nm (FITC), emissie 435-448 nm (DAPI) en 523-536 nm (FITC). Er is een volledige dataset toegevoegd voor testen bij Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Daarnaast werd de pijplijn getest met wortelhaargegevens, waarbij beeldvorming werd uitgevoerd met een lichtbladmicroscoop (SPIM) zoals eerder beschreven ^15,16 met Arabidopsis-wortelharen die de genetisch gecodeerde Ca²⁺ reporter NES-YC3.6 tot expressie brachten onder controle van de UBQ10-promotor¹⁷. De zelfgemaakte LabView-software die de camera-acquisitie, monstervertaling en sluiter van de lichtbladmicroscoop regelde, maakte de observatie van de twee cpVenus- en CFP-kanalen mogelijk, maar ook de visualisatie van hun verhouding in realtime. Elk verhoudingsbeeld van de time-lapse vertegenwoordigde een projectie met maximale intensiteit (MIP) tussen de fluorescentiekanalen cpVenus en CFP, beelden verkregen uit 15 plakjes van het monster met een tussenruimte van 3 μm. De time-lapse cpVenus/CFP-ratio van MIP’s werd opgeslagen en direct gebruikt voor de AMEBaS-analyse.

Hoewel deze pijplijn kan werken met meerdere soorten groeiende en migrerende cellen, is deze speciaal ontworpen om groeiende cellen te analyseren die uitsluitend aan het uiteinde groeien, zoals pollenbuizen, wortelharen en schimmeldraden, waar er een overeenkomst is van de niet-groeiende cytoplasmatische regio’s tussen frames. Als een dergelijke correspondentie niet aanwezig is, moet de gebruiker de optie complete_skeletonization kiezen in stap 1.3.1.1 (zie de sectie Discussie voor meer details).

Figuur 1: Een overzicht van de pipeline workflow. De AMEBaS-pijplijn analyseert en verwerkt microscopisch kleine time-lapses in drie hoofdstappen: Single-Cell Segmentation, Midline Tracing en Kymograph Generation. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.