AMEBaS:分極単一細胞のレシオメトリック蛍光タイムラプスの自動正中線抽出とバックグラウンドサブトラクション
概要
分極した単一細胞の細胞内動態を解析する現在の方法は、多くの場合、手作業であり、標準化されていません。この原稿では、単一偏光細胞の正中線抽出を自動化し、ユーザーフレンドリーなオンラインインターフェースでタイムラプスからの時空間挙動を定量化するための新しい画像解析パイプラインを紹介します。
Abstract
細胞極性は、空間的に集中した分子と構造の集合体によって確立される巨視的な現象であり、細胞内レベルでの特殊なドメインの出現で最高潮に達します。これは、細胞分裂、成長、遊走などの主要な生物学的機能の根底にある非対称な形態学的構造の発達に関連しています。さらに、細胞極性の破壊は、癌や胃異形成などの組織関連疾患に関連しています。
個々の偏光細胞における蛍光レポーターの時空間動態を評価する現在の方法では、細胞の長軸に沿って正中線をトレースする手作業が必要になることが多く、時間がかかり、強いバイアスが発生しがちです。さらに、レシオメトリック分析では、2つの蛍光チャンネルを使用してレポーター分子の不均一な分布を補正できますが、バックグラウンド減算手法は恣意的であることが多く、統計的な裏付けがありません。
この論文では、細胞極性(花粉管/根毛の成長と細胞質イオン動態)のモデルを使用して、単一細胞の時空間的挙動を自動化および定量化するための新しい計算パイプラインを紹介します。レシオメトリック画像を処理し、細胞内の動態と増殖の定量的表現を抽出するために、3段階のアルゴリズムが開発されました。最初のステップでは、背景からセルをセグメント化し、ピクセル強度空間の閾値化技術によってバイナリマスクを生成します。2 番目のステップでは、スケルトン化操作によってセルの正中線を通るパスをトレースします。最後に、3番目のステップでは、処理されたデータをレシオメトリックタイムラプスとして提供し、レシオメトリックキモグラフ(すなわち、経時的な1D空間プロファイル)を生成します。成長する花粉管から遺伝子コードされた蛍光レポーターで取得したレシオメトリック画像からのデータを使用して、分析法のベンチマークを行いました。このパイプラインにより、分極された細胞の正中線に沿った時空間動態をより速く、より偏りが少なく、より正確に表現できるため、細胞極性を調べるために利用できる定量的ツールキットが進歩します。AMEBaS Pythonのソースコードは、https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
細胞極性は、空間的に集中した分子と構造の集合体の協調的な作用が、特殊な形態学的細胞内ドメインの確立で最高潮に達する基本的な生物学的プロセスです1。細胞分裂、増殖、遊走はこのような極性部位に依存していますが、その喪失は上皮組織関連疾患の癌と関連しています2。
頂端に増殖する細胞は極性の劇的な例であり、先端の極性部位は通常、細胞外の手がかりに再配向する3。これらには、神経突起、真菌菌糸、根毛、花粉管の発達が含まれ、複数の細胞プロセスが細胞の先端からすねに向かって顕著な違いを示します。特に花粉管では、アクチン重合、小胞輸送、イオン濃度が著しく分極し、先端に焦点を絞った勾配を示す4。花粉管は顕花植物の雄性配偶体であり、単一細胞で知られている最速の成長率の1つで細胞の頂点でのみ成長することにより、精子細胞を胚珠に送達する役割を担っています。カルシウム5(Ca2+)やプロトン6(H+)などのイオンの先端に焦点を絞った勾配は、花粉管の成長を維持する上で主要な役割を果たし、二重受精で最高潮に達する主要な生物学的機能を達成するために不可欠です5,6。したがって、頂端増殖細胞の正中線に沿った時空間動態を定量的に解析する手法は、分極増殖の根底にある細胞および分子メカニズムを調査するために不可欠です7,8,9。研究者は、細胞の正中線(列など)のピクセル強度を経時的(行など)で表すマトリックスであるキモグラフを使用することが多く、対角線上の細胞の成長と移動を視覚化できます(図1)。キモグラフは、その有用性にもかかわらず、正中線を手作業でトレースして抽出されることが多く、バイアスや人為的ミスが発生しやすく、かなり手間がかかります。これは、AMEBaSと名付けられた本明細書で紹介するパイプラインの最初の特徴である正中線抽出の自動化された方法を必要とします:偏光された単一細胞のレシオメトリック蛍光タイムラプスのユートマティックMidline EエクストラクションおよびBackground Sウブトラクション。
実験手順に関しては、単一細胞における目的のイオン/分子/種の定量的イメージングは、遺伝的にコードされた蛍光プローブ10を用いて達成することができる。拡大し続ける選択肢の中で、レシオメトリックプローブは、目的の分子に結合/非結合するときに異なる蛍光波長を発するため、最も正確なプローブの1つです11。これにより、2つのチャンネルの比からチャンネル特異的なバックグラウンドを差し引いた値を使用することで、プローブの細胞内濃度の空間的不均一性を補正することができます。しかし、各チャンネルや時点の背景閾値を推定することは、画像の隅が中心に対して光度が変動するシェーディングなどの効果や、蛍光色素の退色(光退色)による時間的に変化することが多いため、複雑な作業になる可能性があります12。複数の方法が考えられるが、本稿では、Isodataアルゴリズム13で得られたセグメンテーション閾値を用いてバックグラウンド強度を自動的に決定し、これを標準として多項式回帰によってフレーム間で平滑化することを提案している。しかし、12で除去した標的細胞とは無関係な蛍光の不均一性に由来する空間成分は、この方法では無視された。自動閾値はいくつかの方法で実行できますが、Isodataアルゴリズムは経験的に最良の結果を生み出しました。したがって、自動バックグラウンド値減算とレシオメトリック計算は、AMEBaS(図1)の2番目の主な機能であり、これらをまとめると、デュアルチャンネル蛍光顕微鏡画像のスタックを入力として受け取り、細胞の正中線とチャンネル固有のバックグラウンドを推定し、バックグラウンド減算、平滑化、および外れ値除去後に両方のチャンネルとその比率(メイン出力#1)のキモグラフを出力します。 レシオメトリック画像のスタック(メイン出力#2)と一緒に。
AMEBaSは、花粉特異的LAT52プロモーター下で発現したCa2+ (CaMeleon)8 またはpH(pH)6 レシオメトリックセンサーを用いて、顕微鏡下で得られた成長中のシロイヌナズナ花粉管の蛍光タイムラプスで試験されました。倒立顕微鏡、表面照射型カメラ(2560画素×2160画素、画素サイズ6.45μm)、蛍光イルミネーター、水浸対物レンズ63倍、1.2NAを組み合わせて、各チャンネルの画像を4秒ごとに撮影した。CaMeleonのフィルター設定は、励起426-450 nm(CFP)および505-515 nm(YFP)、発光458-487 nm(CFP)および520-550 nm(YFP)であり、pHluorinでは励起318-390 nm(DAPI)および428-475 nm(FITC)、発光435-448 nm(DAPI)および523-536 nm(FITC)であった。Zenodoでテストするための完全なデータセットが追加されました(DOI:10.5281/zenodo.7975350)14。
さらに、パイプラインは、UBQ10プロモーター17の制御下で遺伝的にコードされたCa2+レポーターNES-YC3.6を発現するシロイヌナズナの根毛を用いて、前述のようにライトシート顕微鏡(SPIM)でイメージングを行った15,16。ライトシート顕微鏡のカメラ取得、サンプル変換、シャッターを制御する自作のLabViewソフトウェアにより、2つのcpVenusチャンネルとCFPチャンネルの観察だけでなく、それらの比率をリアルタイムで視覚化することもできました。タイムラプスの各比率画像は、3 μm間隔のサンプルの15スライスから得られたcpVenus蛍光チャンネル画像とCFP蛍光チャンネル画像の間の最大強度投影(MIP)を表しています。MIPのタイムラプスcpVenus/CFP比を保存し、AMEBaS解析に直接使用しました。
このパイプラインは、複数の種類の増殖細胞と遊走細胞を扱うことができますが、花粉管、根毛、真菌菌糸など、フレーム間に成長しない細胞質領域が対応している先端のみで成長する成長細胞を分析するために特別に設計されました。このような対応が存在しない場合、ユーザーはステップ 1.3.1.1 で complete_skeletonization オプションを選択する必要があります (詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください)。
図 1: パイプライン ワークフローの概要。 AMEBaSパイプラインは、シングルセルセグメンテーション、ミッドライントレーシング、キモグラフ生成の3つの主要なステップで、顕微鏡のタイムラプスを解析および処理します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する新しい方法は、偏光細胞の蛍光顕微鏡画像スタックの解析を合理化および自動化するための強力なツールです。ImageJ Kymographプラグインなど、文献に記載されている現在の方法では、対象の偏光細胞の正中線を手動でトレースする必要がありますが、この作業は時間がかかるだけでなく、人為的ミスも発生しやすい作業です。このパイプラインにおける正中線の定義は、スケル…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、FAPESP助成金2015/22308-2、2019/23343-7、2019/26129-6、2020/06744-5、2021/05363-0、CNPq、NIH R01助成金GM131043、およびNSF助成金MCB1714993、MCB1930165の財政的支援に感謝します。根毛データは、Andrea Bassi教授とAlex Costa教授の指導の下、インフラストラクチャを使用して作成されました。
Materials
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
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