AMEBaS: estrazione automatica della linea mediana e sottrazione di fondo di time-lapse di fluorescenza raziometrica di singole cellule polarizzate

La polarità cellulare è un processo biologico fondamentale in cui l’azione concertata di un insieme di molecole e strutture spazialmente concentrate culmina nella creazione di domini subcellulari morfologici specializzati^. La divisione, la crescita e la migrazione cellulare si basano su tali siti di polarità, mentre la sua perdita è stata associata al cancro nei disturbi legati al tessuto epiteliale².

Le cellule a crescita apicale sono un esempio drammatico di polarità, in cui il sito di polarità all’apice in genere si riorienta verso i segnali extracellulari³. Questi includono lo sviluppo di neuriti, ife fungine, peli radicali e tubi pollinici, dove più processi cellulari mostrano differenze pronunciate dalla punta della cellula verso lo stinco. Nei tubetti pollinici, in particolare, la polimerizzazione dell’actina, il traffico delle vescicole e le concentrazioni ioniche sono marcatamente polarizzate, mostrando gradienti focalizzati sulla punta⁴. I tubi pollinici sono i gametofiti maschili delle piante da fiore e sono responsabili della consegna degli spermatozoi all’ovulo crescendo esclusivamente all’apice della cellula a uno dei tassi di crescita più rapidi conosciuti per una singola cellula. I gradienti focalizzati sulla punta di ioni come il calcio 5 (Ca²+) e i protoni 6 (H⁺) svolgono un ruolo importante nel sostenere la crescita del tubo pollinico, che è essenziale per svolgere la sua principale funzione biologica che culmina in una doppia fecondazione ^5,6. Pertanto, metodi quantitativi per analizzare le dinamiche spazio-temporali lungo la linea mediana delle cellule in crescita apicale sono essenziali per studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della crescita polarizzata ^7,8,9. I ricercatori usano spesso i chimografi, cioè una matrice che rappresenta l’intensità dei pixel della linea mediana della cellula (ad esempio, le colonne) nel tempo (ad esempio, le righe), che consente di visualizzare la crescita e la migrazione cellulare in diagonale (Figura 1). Nonostante la loro utilità, i kymografi vengono spesso estratti tracciando manualmente la linea mediana, essendo soggetti a pregiudizi ed errori umani pur essendo piuttosto laboriosi. Ciò richiede un metodo automatizzato di estrazione della linea mediana che è la prima caratteristica della pipeline qui introdotta denominata AMEBaS: un’estrazione automatica dellalinea Ee un’estrazioneBa ckground Sdi time lapse di fluorescenza raziometrica di singole cellule polarizzate.

In termini di procedure sperimentali, l’imaging quantitativo di ioni/molecole/specie di interesse in singole cellule può essere ottenuto con sonde fluorescenti geneticamente codificate¹⁰. Tra le scelte in continua espansione, le sonde raziometriche sono una delle più accurate poiché emettono diverse lunghezze d’onda di fluorescenza quando sono legate/non legate alle molecole di interesse¹¹. Ciò consente di correggere l’eterogeneità spaziale nella concentrazione intracellulare della sonda utilizzando il rapporto di due canali con il loro sfondo specifico del canale sottratto. Tuttavia, stimare la soglia di sfondo per ogni canale e punto temporale può essere un compito complesso poiché spesso varia nello spazio a causa di effetti come l’ombreggiatura, in cui gli angoli dell’immagine hanno variazioni di luminosità rispetto al centro, e nel tempo a causa dello sbiadimento del fluoroforo (fotosbiancamento)¹². Sebbene esistano diversi metodi possibili, questo manoscritto propone di determinare automaticamente l’intensità di fondo utilizzando la soglia di segmentazione ottenuta con l’algoritmo Isodata¹³, che viene poi smussata attraverso i fotogrammi attraverso la regressione polinomiale come standard. Le componenti spaziali derivanti dall’eterogeneità della fluorescenza non correlate alla cellula bersaglio rimossa in¹², tuttavia, sono state ignorate da questo metodo. La soglia automatica può essere eseguita con diversi metodi, ma l’algoritmo Isodata ha prodotto i migliori risultati empiricamente. Pertanto, la sottrazione automatica del valore di fondo e il calcolo raziometrico sono la seconda caratteristica principale di AMEBaS (Figura 1), che, nel suo insieme, riceve come input una pila di immagini di microscopia a fluorescenza a doppio canale, stima la linea mediana della cellula e lo sfondo specifico del canale e produce chimografi di entrambi i canali e del loro rapporto (output principale #1) dopo la sottrazione dello sfondo, il livellamento e la rimozione dei valori anomali. insieme a una pila di immagini raziometriche (Main Output #2).

AMEBaS è stato testato con time lapse di fluorescenza di tubi pollinici di Arabidopsis in crescita ottenuti al microscopio, con sensori raziometrici di Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ o pH (pHluorin)⁶ espressi sotto il promotore LAT52 specifico per il polline. Le immagini di ciascun canale sono state scattate ogni 4 secondi accoppiate a un microscopio invertito, una fotocamera frontale illuminata (2560 pixel × 2160 pixel, dimensione pixel 6,45 μm), un illuminatore a fluorescenza e un obiettivo a immersione in acqua 63x, 1,2NA. Le impostazioni dei filtri utilizzati per CaMeleon erano: eccitazione 426-450 nm (CFP) e 505-515 nm (YFP), emissione 458-487 nm (CFP) e 520-550 nm (YFP), mentre per pHluorin, eccitazione 318-390 nm (DAPI) e 428-475 nm (FITC), emissione 435-448 nm (DAPI) e 523-536 nm (FITC). È stato aggiunto un set di dati completo per i test su Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Inoltre, la pipeline è stata testata con i dati dei peli radicolari, dove l’imaging è stato eseguito con un microscopio a foglio luminoso (SPIM) come descritto in precedenza ^15,16 con peli radicali di Arabidopsis che esprimono il reporter Ca²⁺ geneticamente codificato NES-YC3.6 sotto il controllo del promotore UBQ10¹⁷. Il software LabView che controllava l’acquisizione della telecamera, la traslazione del campione e l’otturatore del microscopio a foglio luminoso permetteva l’osservazione dei due canali cpVenus e CFP, ma anche la visualizzazione del loro rapporto in tempo reale. Ogni immagine del rapporto del time-lapse rappresentava una proiezione di massima intensità (MIP) tra le immagini dei canali fluorescenti cpVenus e CFP ottenute da 15 fette del campione distanziate di 3 μm l’una dall’altra. Il rapporto time-lapse cpVenus/CFP dei MIP è stato salvato e utilizzato direttamente per l’analisi AMEBaS.

Sebbene questa pipeline possa funzionare con più tipi di cellule in crescita e in migrazione, è stata specificamente progettata per analizzare le cellule in crescita che crescono esclusivamente all’estremità, come i tubi pollinici, i peli delle radici e le ife fungine, dove c’è una corrispondenza delle regioni citoplasmatiche non in crescita tra i frame. Quando tale corrispondenza non è presente, l’utente deve scegliere l’opzione complete_skeletonization nel passaggio 1.3.1.1 (vedere la sezione Discussione per maggiori dettagli).

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro della pipeline. La pipeline AMEBaS analizza ed elabora i time lapse microscopici in tre fasi principali: segmentazione a cellula singola, tracciamento della linea mediana e generazione del cimografo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.