AMEBaS: Extração Automática da Linha Média e Subtração de Fundo de Time-Lapses de Fluorescência Ratiométrica de Células Individuais Polarizadas

A polaridade celular é um processo biológico fundamental no qual a ação concertada de um conjunto de moléculas e estruturas espacialmente concentradas culmina no estabelecimento de domínios morfológicos subcelulares^{especializados1}. A divisão celular, o crescimento e a migração dependem desses sítios de polaridade, enquanto sua perda tem sido associada ao câncer em desordens relacionadas ao tecido^epitelial2.

Células em crescimento apical são um exemplo dramático de polaridade, onde o local de polaridade na ponta tipicamente se reorienta para pistas extracelulares³. Estes incluem neuritos em desenvolvimento, hifas fúngicas, pelos radiculares e tubos polínicos, onde múltiplos processos celulares mostram diferenças pronunciadas da ponta da célula em direção à haste. Em tubos polínicos, em particular, a polimerização de actina, o tráfego de vesículas e as concentrações iônicas são marcadamente polarizados, mostrando gradientes focados na ponta⁴. Os tubos polínicos são os gametófitos masculinos das plantas com flores e são responsáveis por entregar os espermatozoides ao óvulo, crescendo exclusivamente no ápice da célula a uma das taxas de crescimento mais rápidas conhecidas para uma única célula. Os gradientes focados na ponta de íons como cálcio 5 (Ca²+) e prótons 6 (H⁺) desempenham um papel importante na sustentação do crescimento do tubo polínico, o que é essencial para cumprir sua principal função biológica que culmina em uma dupla fertilização ^5,6. Assim, métodos quantitativos para analisar a dinâmica espaço-temporal ao longo da linha média de células em crescimento apical são essenciais para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao crescimento polarizado7,8,9. Os pesquisadores geralmente usam quimógrafos, ou seja, uma matriz que representa as intensidades de pixel da linha média da célula (por exemplo, colunas) ao longo do tempo (por exemplo, linhas), o que permite visualizar o crescimento e a migração da célula na diagonal (Figura 1). Apesar de sua utilidade, os quimógrafos são frequentemente extraídos traçando manualmente a linha média, sendo propensos a vieses e erros humanos, além de serem bastante trabalhosos. Isso requer um método automatizado de extração de linha média que é a primeira característica do pipeline introduzido aqui chamado AMEBaS: Automatic Midline Extraction e Background Subtração de lapsos de tempo de fluorescência ratiométrica de células individuais polarizadas.

Em termos de procedimentos experimentais, imagens quantitativas de íons/moléculas/espécies de interesse em células isoladas podem ser obtidas com sondas fluorescentes codificadas^{geneticamente10}. Dentre as escolhas em constante expansão, as sondas ratiométricas são uma das mais precisas, pois emitem diferentes comprimentos de onda de fluorescência quando ligadas/desligadas às moléculas de interesse¹¹. Isso permite corrigir a heterogeneidade espacial na concentração intracelular da sonda usando a razão de dois canais com seu fundo específico do canal subtraído. No entanto, estimar o limiar de fundo para cada canal e ponto de tempo pode ser uma tarefa complexa, pois muitas vezes varia no espaço devido a efeitos como sombreamento, onde os cantos da imagem têm variação de luminosidade em relação ao centro, e no tempo devido ao desbotamento do fluoróforo (fotoclareamento)¹². Embora existam vários métodos possíveis, este artigo propõe determinar a intensidade de fundo automaticamente usando o limiar de segmentação obtido com o algoritmo Isodata¹³, que é então suavizado através de quadros através de regressão polinomial como padrão. Componentes espaciais decorrentes da heterogeneidade da fluorescência não relacionados à célula-alvo removida em¹², no entanto, foram ignorados por este método. O limiar automático pode ser realizado por vários métodos, mas o algoritmo Isodata produziu os melhores resultados empiricamente. Assim, a subtração automática do valor de fundo e o cálculo ratiométrico são a segunda característica principal do AMEBaS (Figura 1), que, em conjunto, recebe como entrada uma pilha de imagens de microscopia de fluorescência de canal duplo, estima a linha média da célula e o fundo específico do canal, e produz quimógrafos de ambos os canais e sua razão (saída principal #1) após subtração, suavização e remoção de outlier, juntamente com uma pilha de imagens ratiometric (saída principal #2).

O AMEBaS foi testado com lapsos de tempo de fluorescência de tubos polínicos de Arabidopsis em crescimento obtidos ao microscópio, com sensores de razão de Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ ou pH (pHluorin)⁶ expressos sob o promotor LAT52 pólen-específico. As imagens de cada canal foram obtidas a cada 4 s acopladas a um microscópio invertido, uma câmera frontal iluminada (2560 pixels × 2160 pixels, tamanho do pixel 6,45 μm), um iluminador de fluorescência e uma lente objetiva de imersão em água 63x, 1.2NA. As configurações dos filtros utilizados para o CaMeleon foram: excitação 426-450 nm (CFP) e 505-515 nm (YFP), emissão 458-487 nm (CFP) e 520-550 nm (YFP), enquanto para pHluorin, excitação 318-390 nm (DAPI) e 428-475 nm (FITC), emissão 435-448 nm (DAPI) e 523-536 nm (FITC). Um conjunto completo de dados foi adicionado para teste em Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Além disso, o duto foi testado com dados de pelos radiculares, onde as imagens foram realizadas com um microscópio de folha de luz (SPIM), como descrito anteriormente ^15,16 com pelos radiculares de Arabidopsis expressando o repórter NES-YC3.6 codificado geneticamente Ca²⁺ sob o controle do promotor UBQ10¹⁷. O software LabView caseiro que controlava a aquisição da câmera, a tradução da amostra e o obturador do microscópio de folha de luz permitiu a observação dos dois canais cpVenus e CFP, mas também a visualização de sua proporção em tempo real. Cada imagem de razão do time-lapse representou uma projeção de intensidade máxima (MIP) entre as imagens dos canais fluorescentes cpVenus e CFP obtidas a partir de 15 cortes da amostra espaçados de 3 μm entre si. A razão de lapso de tempo cpVenus/CFP das MIPs foi salva e usada diretamente para a análise AMEBaS.

Embora esse pipeline possa trabalhar com vários tipos de células em crescimento e migração, ele foi projetado especificamente para analisar células em crescimento que crescem exclusivamente na ponta, como tubos polínicos, pelos radiculares e hifas fúngicas, onde há uma correspondência das regiões citoplasmáticas não crescentes entre os quadros. Quando tal correspondência não estiver presente, o usuário deve escolher a opção complete_skeletonization na etapa 1.3.1.1 (consulte a seção Discussão para obter mais detalhes).

Figura 1: Uma visão geral do fluxo de trabalho do pipeline. O pipeline AMEBaS analisa e processa lapsos de tempo microscópicos em três etapas principais: Segmentação de célula única, Rastreamento de linha média e Geração de quimógrafo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.