AMEBaS：偏振单细胞比例荧光延时的自动中线提取和背景减法

细胞极性是一个基本的生物学过程，在这个过程中，一系列空间集中的分子和结构的协同作用最终导致了专门的形态亚细胞结构域的建立¹。细胞分裂、生长和迁移依赖于这种极性位点，而其丢失与上皮组织相关疾病中的癌症有关^2。

顶端生长的细胞是极性的一个戏剧性例子，其中尖端的极性位点通常重新定向到细胞外线索³。这些包括发育中的神经突、真菌菌丝、根毛和花粉管，其中多个细胞过程显示出从细胞尖端到小腿的明显差异。特别是在花粉管中，肌动蛋白聚合、囊泡运输和离子浓度明显极化，显示出以尖端为中心的梯度⁴。花粉管是开花植物的雄配子体，负责将精子细胞输送到胚珠，以单个细胞已知的最快生长速度之一仅在细胞的顶端生长。钙⁵ （Ca²+） 和质子 6 （H⁺） 等离子的尖端聚焦梯度在维持花粉管生长中起着重要作用，这对于实现其主要生物学功能至关重要，最终导致双重受精 ^5,6。因此，分析顶端生长细胞中线时空动力学的定量方法对于研究极化生长的细胞和分子机制至关重要^7,8,9。研究人员经常使用kymographs，即表示细胞中线（例如，列）随时间（例如，行）的像素强度的矩阵，这允许可视化细胞在对角线上的生长和迁移（图1）。尽管它们很有用，但 kymograph 经常通过手动跟踪中线来提取，容易出现偏差和人为错误，同时也相当费力。这需要一种自动化的中线提取方法，这是本文介绍的名为AMEBaS的管道的第一个特征：偏振单细胞的比率荧光延时的utomatic Midline Extraction和Background S牵引。

在实验程序方面，单细胞中感兴趣的离子/分子/物种的定量成像可以通过基因编码的荧光探针¹⁰实现。在不断扩大的选择中，比率探针是最准确的探针之一，因为它们在与目标分子结合/未结合时会发出不同的荧光波长¹¹。这允许通过使用两个通道的比率来校正探针细胞内浓度的空间异质性，并减去它们的通道特定背景。然而，估计每个通道和时间点的背景阈值可能是一项复杂的任务，因为它经常在空间上因阴影等效应而变化，其中图像的角落相对于中心有光度变化，并且由于荧光团的褪色（光漂白）而在时间上变化¹²。尽管有多种可能的方法，但本文建议使用使用 Isodata 算法¹³ 获得的分割阈值自动确定背景强度，然后通过多项式回归作为标准在帧之间进行平滑处理。然而，该方法忽略了与¹²中去除的靶细胞无关的荧光异质性产生的空间成分。自动阈值可以通过多种方法执行，但 Isodata 算法在经验上产生了最佳结果。因此，自动背景值减法和比率计算是 AMEBaS 的第二个主要功能（图 1），它一起接收一堆双通道荧光显微镜图像作为输入，估计细胞的中线和通道特定背景，并在背景减去、平滑和异常值去除后输出两个通道及其比率的 kymograph（主输出 #1）， 以及一堆比例图像（主输出 #2）。

使用在显微镜下获得的生长拟南芥花粉管的荧光延时测试AMEBaS，使用在花粉特异性LAT52启动子下表达的Ca²⁺ （CaMeleon）⁸ 或pH（pHluorin）⁶ 比率传感器。每 4 秒拍摄一次来自每个通道的图像，耦合到倒置显微镜、前照式相机（2560 像素× 2160 像素，像素大小 6.45 μm）、荧光照明器和水浸物镜 63x，1.2NA。用于CaMeleon的滤光片设置为：激发波长426-450 nm（CFP）和505-515 nm（YFP），发射波长458-487 nm（CFP）和520-550 nm（YFP），而pHluorin的激发波长为318-390 nm（DAPI）和428-475 nm（FITC），发射波长为435-448 nm（DAPI）和523-536 nm（FITC）。添加了一个完整的数据集，用于在 Zenodo （DOI： 10.5281/zenodo.7975350）¹⁴ 进行测试。

此外，使用根毛数据测试了管道，其中使用光片显微镜 （SPIM） 进行成像，如前所述 15,16 在 UBQ10 启动子的控制下^，拟南芥根毛表达遗传编码的 Ca²⁺ 报告基因 NES-YC3.6¹⁷。自制的LabView软件控制了光片显微镜的相机采集、样品平移和快门，可以观察两个cpVenus和CFP通道，还可以实时显示它们的比率。延时摄影的每个比率图像都代表了从间隔 3 μm 的 15 个样品切片中获得的 cpVenus 和 CFP 荧光通道图像之间的最大强度投影 （MIP）。MIPs的延时cpVenus/CFP比值被保存下来，并直接用于AMEBaS分析。

尽管该管道可以处理多种类型的生长和迁移细胞，但它专门设计用于分析仅在尖端生长的生长细胞，例如花粉管、根毛和真菌菌丝，其中框架之间存在非生长细胞质区域的对应关系。当不存在此类对应关系时，用户应在步骤 1.3.1.1 中选择 “complete_skeletonization ”选项（有关详细信息，请参阅“讨论”部分）。

图 1：管道工作流概述。 AMEBaS 流程通过三个主要步骤分析和处理微观时间流逝：单细胞分割、中线追踪和 Kymograph 生成。 请点击这里查看此图的较大版本.