AMEBaS: Extracción automática de la línea media y sustracción de fondo de time-lapses de fluorescencia radiométrica de células individuales polarizadas

La polaridad celular es un proceso biológico fundamental en el que la acción concertada de una colección de moléculas y estructuras espacialmente concentradas culmina en el establecimiento de dominios morfológicos subcelulares especializados. La división, el crecimiento y la migración celular dependen de dichos sitios de polaridad, mientras que su pérdida se ha asociado con el cáncer en trastornos relacionados con el tejido epitelial².

Las células que crecen apicalmente son un ejemplo dramático de polaridad, donde el sitio de polaridad en la punta generalmente se reorienta a las señales extracelulares³. Estos incluyen neuritas en desarrollo, hifas fúngicas, pelos radiculares y tubos polínicos, donde múltiples procesos celulares muestran diferencias pronunciadas desde la punta de la célula hacia el vástago. En los tubos polínicos, en particular, la polimerización de actina, el tráfico de vesículas y las concentraciones iónicas están marcadamente polarizadas, mostrando gradientes centrados en la punta⁴. Los tubos polínicos son los gametofitos masculinos de las plantas con flores y son responsables de llevar los espermatozoides al óvulo al crecer exclusivamente en el ápice de la célula a una de las tasas de crecimiento más rápidas conocidas para una sola célula. Los gradientes centrados en la punta de iones como el calcio 5 (^Ca2+) y los protones 6 (H⁺) juegan un papel importante en el mantenimiento del crecimiento del tubo polínico, que es esencial para cumplir su función biológica principal que culmina en una doble fertilización ^5,6. Por lo tanto, los métodos cuantitativos para analizar la dinámica espacio-temporal a lo largo de la línea media de las células en crecimiento apical son esenciales para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen al crecimiento polarizado ^7,8,9. Los investigadores a menudo usan quimógrafos, es decir, una matriz que representa las intensidades de píxeles de la línea media de la célula (por ejemplo, columnas) a través del tiempo (por ejemplo, filas), lo que permite visualizar el crecimiento y la migración celular en diagonal (Figura 1). A pesar de su utilidad, los quimógrafos se extraen con frecuencia trazando manualmente la línea media, siendo propensos a sesgos y errores humanos, además de ser bastante laboriosos. Esto requiere un método automatizado de extracción de la línea media que es la primera característica de la tubería introducida en este documento llamada AMEBaS: una extracción Midline Eutomática y unaextracción S de Mckground de lapsos de tiempo defluorescencia ratiométricos de celdas individuales polarizadas.

En cuanto a los procedimientos experimentales, se pueden obtener imágenes cuantitativas de iones/moléculas/especies de interés en células individuales con sondas fluorescentes codificadas genéticamente¹⁰. Entre las opciones cada vez más amplias, las sondas radiométricas son una de las más precisas, ya que emiten diferentes longitudes de onda de fluorescencia cuando se unen/desunen a las moléculas de interés¹¹. Esto permite corregir la heterogeneidad espacial en la concentración intracelular de la sonda utilizando la relación de dos canales con su fondo específico del canal restado. Sin embargo, estimar el umbral de fondo para cada canal y punto de tiempo puede ser una tarea compleja, ya que a menudo varía en el espacio debido a efectos como el sombreado, donde las esquinas de la imagen tienen variación de luminosidad en relación con el centro, y en el tiempo debido al desvanecimiento del fluoróforo (fotoblanqueo)¹². Aunque existen múltiples métodos posibles, este manuscrito propone determinar la intensidad de fondo de forma automática utilizando el umbral de segmentación obtenido con el algoritmo Isodata¹³, que luego se suaviza a través de fotogramas mediante regresión polinómica como estándar. Sin embargo, los componentes espaciales derivados de la heterogeneidad de la fluorescencia no relacionada con la célula diana eliminada en¹² fueron ignorados por este método. El umbral automático se puede realizar mediante varios métodos, pero el algoritmo Isodata produjo los mejores resultados empíricamente. Por lo tanto, la sustracción automática del valor de fondo y el cálculo radiométrico son la segunda característica principal de AMEBaS (Figura 1), que, en conjunto, recibe como entrada una pila de imágenes de microscopía de fluorescencia de doble canal, estima la línea media de la célula y el fondo específico del canal, y genera cimogramas de ambos canales y su relación (salida principal # 1) después de la sustracción de fondo, el suavizado y la eliminación de valores atípicos. junto con una pila de imágenes radiométricas (salida principal #2).

AMEBaS se probó con lapsos de tiempo de fluorescencia de tubos polínicos de Arabidopsis en crecimiento obtenidos bajo un microscopio, ya sea con sensores radiométricos de Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ o pH (pHluorin)⁶ expresados bajo el promotor LAT52 específico del polen. Las imágenes de cada canal se tomaron cada 4 s acopladas a un microscopio invertido, una cámara con iluminación frontal (2560 píxeles × 2160 píxeles, tamaño de píxel 6,45 μm), un iluminador de fluorescencia y una lente objetivo de inmersión en agua 63x, 1.2NA. Los ajustes de los filtros utilizados para CaMeleon fueron: excitación 426-450 nm (CFP) y 505-515 nm (YFP), emisión 458-487 nm (CFP) y 520-550 nm (YFP), mientras que para pHluorin, excitación 318-390 nm (DAPI) y 428-475 nm (FITC), emisión 435-448 nm (DAPI) y 523-536 nm (FITC). Se agregó un conjunto completo de datos para las pruebas en Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Además, la tubería se probó con datos de pelos radiculares, donde se realizaron imágenes con un microscopio de lámina de luz (SPIM) como se describió previamente ^15,16 con pelos radiculares de Arabidopsis que expresan el reportero Ca²⁺ codificado genéticamente NES-YC3.6 bajo el control del promotor UBQ10¹⁷. El software casero LabView, que controlaba la adquisición de la cámara, la traslación de la muestra y el obturador del microscopio de lámina de luz, permitió la observación de los dos canales cpVenus y CFP, pero también la visualización de su relación en tiempo real. Cada imagen de relación del lapso de tiempo representó una proyección de máxima intensidad (MIP) entre las imágenes de los canales fluorescentes cpVenus y CFP obtenidas a partir de 15 cortes de la muestra espaciados a 3 μm de distancia. Se guardó la relación cpVenus/CFP de lapso de tiempo de los MIP y se utilizó directamente para el análisis AMEBaS.

Aunque esta tubería puede trabajar con múltiples tipos de células en crecimiento y migración, fue diseñada específicamente para analizar células en crecimiento que crecen exclusivamente en la punta, como los tubos polínicos, los pelos radiculares y las hifas fúngicas, donde existe una correspondencia de las regiones citoplasmáticas no en crecimiento entre los marcos. Cuando dicha correspondencia no está presente, el usuario debe elegir la opción complete_skeletonization en el paso 1.3.1.1 (consulte la sección Discusión para obtener más detalles).

Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo de la canalización. La canalización AMEBaS analiza y procesa lapsos de tiempo microscópicos en tres pasos principales: segmentación de una sola célula, trazado de la línea media y generación de quimógrafos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.