Imágenes de bioluminiscencia es una herramienta bien conocida para la localización de tumores y metástasis, pero la cuantificación de estas imágenes a menudo requiere cálculos complejos e instrumentos particulares. Se describe el método luminoscore de usar fácil, sobre la base de condiciones de adquisición precisas, que no requiere de cálculos, y que permite la carga tumoral y la respuesta al tratamiento a ser monitoreados en modelos de ratón.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
La detección de células tumorales Early sigue siendo un reto y es crucial para la mejora de la eficacia del tratamiento del cáncer. In vivo imágenes de bioluminiscencia (BLI) es una técnica óptica no invasivo muy sensible, ampliamente utilizado para el seguimiento de tumores en animales pequeños. Células de luciferasa que expresan la luciérnaga se usan comúnmente para tales experimentos 1,2. Este oxigenasa oxida D-luciferina con el oxígeno molecular, pero requiere dos cofactores – Mg 2+ y trifosfato de adenosina 3. La luciferasa de luciérnaga es más adecuado para formación de imágenes in vivo de la luciferasa de renilla 4, ya que su rendimiento cuántico es mayor.
El sustrato oxidado – oxiluciferina – emite espontáneamente un fotón para volver a su estado fundamental y luego se vuelve inactiva. Los fotones emitidos tienen una longitud de onda máxima alrededor de 530 nm. Una cámara de alta sensibilidad puede detectar los fotones luminiscentes desde el interior de un pequeño animal y proporcionar imágenes que lo hacen POSSIble para localizar las células tumorales.
La capacidad de cuantificar con precisión la carga tumoral por recuentos de fotones podría servir como una herramienta poderosa y sensible para la cuantificación de la eficacia del tratamiento. Debido a que los efectos del tratamiento pueden ser detectados antes, esta sensibilidad puede hacer que sea posible determinar el momento exacto en el que un tratamiento sea efectiva.
Cuantificación absoluta de fotones total emitida es muy complejo. El número de fotones recogidos depende de la profundidad del tumor y en los órganos de los fotones son emitidos a través de. Coeficientes de corrección en base a los coeficientes de absorción de tejido pueden ser calculados 5, pero la cuantificación absoluta del número de células tumorales requiere conocer el número de fotones emitidos por cada célula tumoral. Por otra parte, la expresión de luciferasa, como el de muchos genes informadores (por ejemplo., Proteínas fluorescentes) no es homogénea, incluso en una población celular derivada de un único clon 6. El número de luciferproteínas ase en las células no se pueden calcular con exactitud. El establecimiento de las condiciones experimentales estandarizadas por lo tanto parece ser crucial para un análisis semi-cuantitativo fiable.
Se aplicó el método de luminoscore a dos modelos diferentes de linfoma de ratón 7,8,9. En estos modelos, las células tumorales singénicas se inyectan en el ojo o debajo de la piel para obtener, respectivamente, un modelo primario linfoma intraocular (PIOL) y un linfoma subcutáneo modelo (SCL). En cada uno de estos modelos ortotópico, el tratamiento se administra in situ, siete días después de la inoculación del tumor para PIOL y cuando el tumor ha alcanzado 0,5 a 0,7 cm en su diámetro más grande para SCL.
Se utilizó el método luminoscore para vigilar los efectos de la terapia con CpG in situ, previamente demostrado ser eficaz 7,10,11. CpG es una secuencia de oligonucleótidos y un ligando de TLR9, que a su vez es un receptor intracelular expresada por numerosos cells del sistema inmune, incluyendo células dendríticas, linfocitos B, monocitos y células asesinas naturales. CpG DNA es una secuencia de ADN 20-mero que contiene el CpG (CG) motivo inmunoestimulante; el control (ODN-control) es la misma secuencia de ADN 20-mer, excepto que la secuencia CG inmunoestimulador se invierte (GC). Compromiso TLR9 en el linfoma murino que estamos estudiando induce la apoptosis 10, activa el sistema inmunológico 12, y por lo tanto reduce significativamente la carga tumoral 7,11.
Aquí se describe un método estandarizado para la cuantificación de la carga tumoral y la respuesta al tratamiento a través de imágenes bioluminiscentes. Este método se basa en diferentes aspectos del procedimiento de formación de imágenes, desde la adquisición hasta el análisis, para optimizar la fiabilidad, reproducibilidad, la dependencia no usuario, y la significación estadística. Un índice de bioluminiscencia cuantificación se atribuye a cada ratón; este valor, lo que llamamos un luminoscore, se puede comparar no sólo entre los animales, pero alpor lo que entre los experimentos.
En este trabajo, nos centramos en el procedimiento de formación de imágenes de bioluminiscencia, así como la cuantificación de imagen por el método luminoscore. Mostramos la eficacia de este método de control de la inyección, el seguimiento de la carga tumoral, y la evaluación de la eficacia de tratamiento del cáncer en situ. Cada uno de estos puntos se ilustra en los resultados representativos de experimentos utilizando diferentes modelos de ratón para resaltar la capacidad de adaptación del método luminoscore.
absorción de la luz por los órganos y tejidos sigue siendo una limitación de imágenes de bioluminiscencia, a pesar de esta limitación es inherente a cualquier técnica de imagen óptica. En el contexto de nuestro enfoque, se espera que los efectos de las estructuras anatómicas en el luminoscore tener baja variabilidad siempre que los estudios se realizan en un modelo dado (lugar y la hebra de ratón), lo que permite entonces las comparaciones. La bioluminiscencia no necesita luz de excitación y por lo tanto se adapta más a todo el cuerpo de imágenes in vivo de fluorescencia.
La resolución espacial es también una limitación de imágenes de bioluminiscencia, y la ubicación precisa del órgano del que se emiten fotones de bioluminiscencia sigue siendo difícil. Sin embargo, un buen conocimiento del modelo puede ayudar en la localización cualitativa de los sitios de tumor. La única salida de este método basado en la bioluminiscencia es la luminoscore. Ubicación no influye en la luminoscore porque el margen de ganancia manual de Región de Interest (ROI) cubre todo el ratón. Por último, la luciferasa de luciérnaga requiere oxígeno. En consecuencia, imágenes de bioluminiscencia generalmente subestima tumores necróticos. Una vez más, se requiere un buen conocimiento de este aspecto del modelo.
En este trabajo, nuestra intención no es evaluar la eficacia de CpG como un fármaco antitumoral (que ya ha sido demostrado 7,9,11), pero para describir un método que permite la comparación de datos de bioluminiscencia. Hemos hecho describe un método para cuantificar la carga tumoral destinado a ayudar a estandarizar el protocolo de adquisición para comparar diferentes ensayos en diferentes lugares en diferentes momentos y que no requiere de cálculos por ordenador. Para asegurar la reproducibilidad y la correcta cuantificación de flujo de fotones, el dispositivo de imagen debe ser calibrado con una referencia de la luz para los dispositivos de fabricación casera o según lo recomendado por el proveedor de dispositivos comerciales.
Nuestro protocolo requiere una cuidadosa atención a varios p críticaUNTOS: (i) En primer lugar, la calidad de la anestesia ratón es crucial para la obtención de imágenes claras, especialmente en los casos con tiempos de exposición largos. (Ii) La unidad de cuantificación debe ser siempre sea el flujo de fotones debido a radiación depende de la superficie de cada ratón y podría ser irrelevante para la comparación de diferentes ratones. (Iii) Las imágenes de bioluminiscencia no deben contener píxeles saturados, ya que estos podrían sesgar la luminoscore. (iv) hacia atrás y delante adquisición se requieren para recoger todos los fotones emitidos desde el sitio del tumor (es decir, la adquisición de frente no necesariamente puede detectar fotones de la parte posterior del tumor). Varios diferentes dibujos de ROI se ensayaron durante el desarrollo del método luminoscore. Sólo el manual del margen de beneficio dado resultados satisfactorios que son más propensos a ser estadísticamente significativa (datos no mostrados).
Inoue et al. recomiendan una dosis luciferina de 75 mg / kg 13. Mediante el uso de una dosis de 150 mg / kg en vez, el momento de formación de imágenes después de laadministración luciferina no ha cambiado y nos aseguramos de que la meseta dura toda una adquisición larga exposición. Luciferina debe ser el reactivo en exceso durante todo el proceso de adquisición. Dependiendo del modelo, la región de interés se puede adaptar, como se demostró en el modelo SCL donde dibujamos dos ROI por animal. En el modelo SCL, se inyecta el tratamiento cuando el tumor alcanza 0,5 cm en su diámetro más grande para limitar la variabilidad de injerto. Dependiendo de los ratones, el tumor podría haber crecido de manera diferente. Para estandarizar y comparar los ratones, se decidió utilizar una relación entre el lado tratado y no tratado que revela el crecimiento relativo de ambos tumores flancos.
Si no se observa ninguna señal de un ratón inyectado espera que sea positivo, o bien (i) el número de células es muy baja y la señal está por debajo del umbral de detección; o (ii) el ratón carece de oxígeno y requiere atención inmediata.
Varios de los bioluminesc cuantitativaLos análisis cia descrita por varios autores requieren cálculos complejos e instrumentos (por ejemplo, tomografía bioluminiscencia 3D) para acercarse a la cuantificación absoluta de los fotones emitidos bioluminiscencia 5,15. No hay consenso sobre un método para la cuantificación de la bioluminiscencia de forma reproducible, especialmente en modelos de tumores, con una cámara 2D bioluminiscencia. Nuestro objetivo era estandarizar el protocolo de adquisición de imágenes para limitar la dependencia del usuario.
La inyección de CpG in situ después de la inoculación del tumor redujo la carga tumoral en ambos modelos. El método luminoscore puede servir como una herramienta para monitorear la carga tumoral en otros modelos de inmunoterapias tumorales. Monitoreo de la carga tumoral proporciona un método no invasivo que puede mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de crecimiento del tumor y metástasis sin interferir con el microambiente tumoral. La identificación de los animales que hacen y que no responden al tratamiento con este método se ve reforzada por la verificación de sinyección de células tumorales Uccessful al comienzo del experimento.
Nosotros mostramos aquí la capacidad de adaptación del método luminoscore en un modelo SCL utilizando células A20.IIA-luc2. Sin embargo, este método puede ser adaptado a cualquier otro modelo de tumor usando otras líneas celulares siempre que expresan luciferasa, o en el contexto de los estudios de células T (citotóxicas tumor específico de células T, células T reguladoras, etc.). El seguimiento de la transferencia de genes in vivo en el contexto de la terapia génica de enfermedades raras también se podría hacer utilizando el método luminoscore.
Por último, los datos muestran que el método basado en la bioluminiscencia luminoscore permite hacer comparaciones entre los experimentos, ofrece flexibilidad y capacidad de adaptación a las necesidades específicas de experimentación, y es una herramienta útil para los estudios preclínicos longitudinales no invasivos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a las instalaciones de animales del Centro de Investigación Cordelier (CEF, París, Francia), Genethon (Evry, Francia) y Genopole (CERFE, Evry, Francia). Agradecemos a Jo Ann Cahn por su cuidadosa lectura del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Institut National de la Santé et de la Rechercher Médicale, Universidad Descartes de París, Pierre y Marie Universidad de Curie, la Asociación para la Investigación contra el Cáncer, la Dirección de Túnez Générale de la Recherche Scientifique, CMCU el franco-tunecino proyecto y las acciones Thématiques fondos Incitatives de Génopole (ATIGE). JC fue apoyada por las fronteras en la escuela de doctorado Ciencias de la Vida y por una beca del INCA (Instituto Nacional del Cáncer). RBA era un recipiente de subvenciones de la DGRS-INSERM y el CMCU. SD recibió una subvención del Instituto Nacional del Cáncer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |