imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
A detecção precoce de células de tumor permanece um desafio e é essencial para melhorar a eficácia do tratamento do cancro. In vivo imagem de bioluminescência (BLI) é, uma técnica não-invasiva óptica muito sensível, amplamente utilizado para monitorizar tumores em animais de pequeno porte. As células que expressam a luciferase do pirilampo são vulgarmente utilizados para tais experiências 1,2. Este oxigenase oxida D-luciferina com oxigénio molecular, mas requer dois cofatores – Mg 2+ e trifosfato de adenosina 3. Firefly luciferase é mais adequado para imagiologia in vivo do que a luciferase da Renilla 4 porque o seu rendimento quântico é maior.
O substrato oxidado – oxiluciferina – emite um fóton espontaneamente para retornar ao seu estado fundamental e, em seguida, torna-se inativo. Os fótons emitidos têm um comprimento de onda máximo de cerca de 530 nm. Uma câmara de alta sensibilidade podem detectar os fotões luminescentes a partir do interior de um animal pequeno e proporcionar imagens que tornam POSSvel para localizar células tumorais.
A capacidade para quantificar a carga tumoral com precisão pela contagem de fotões pode servir como uma ferramenta poderosa e sensível para a quantificação da eficácia do tratamento. Porque os efeitos do tratamento pode ser detectado mais cedo, esta sensibilidade pode torná-lo possível determinar o momento exato em que um tratamento torna-se eficaz.
quantificação absoluta do total de fótons emitidos é muito complexa. O número de fotões recolhidos depende da profundidade do tumor e nos órgãos os fotões são emitidos através. Os coeficientes de correcção com base em coeficientes de absorção de tecido pode ser calculado 5, mas a quantificação absoluta do número de células tumorais requer conhecer o número de fotões emitidos por cada célula tumoral. Além disso, a expressão de luciferase, como a de muitos genes repórter (por ex., Proteínas fluorescentes) não é homogéneo, mesmo em uma população de células derivadas a partir de um único clone 6. O número de luciferproteínas ase em células não pode ser calculado com exatidão. O estabelecimento de condições experimentais padronizadas aparece, assim, crucial para uma análise semi-quantitativa confiável.
Nós aplicamos o método luminoscore a dois modelos diferentes de linfoma do rato 7,8,9. Nestes modelos, as células tumorais singeneicas são injectados para dentro do olho ou sob a pele para se obter, respectivamente modelo, um modelo de linfoma primário intra-ocular (Piol) e um linfoma subcutânea (SCL). Em cada um destes modelos ortotópicos, o tratamento é administrado in situ, sete dias após a inoculação do tumor para Piol e quando o tumor atingiu 0,5 a 0,7 cm no seu maior diâmetro para SCL.
Foi utilizado o método luminoscore para monitorar os efeitos da terapia em CpG situ, mostrado previamente para ser eficaz 7,10,11. CpG é uma sequência de oligonucleótidos e um ligando de TLR9, que por sua vez é um receptor intracelular expressos por numerosas cells do sistema imune, incluindo as células dendríticas, linfócitos B, monócitos, e células assassinas naturais. CpG-ADN é uma sequência de ADN de 20-mer que contém o CpG (CG) motivo imunoestimulante; o controlo (ODN-controlo) é a mesma sequência de ADN de 20-mer, excepto que a sequência CG imunoestimulante é invertido (GC). Acoplamento TLR9 no linfoma murino que estão a estudar induz a apoptose 10, activa o sistema imunitário 12, e, assim, reduz significativamente a carga do tumor 7,11.
Aqui nós descrevemos um método padronizado para quantificar a carga tumoral e resposta ao tratamento por meio de imagens bioluminescentes. Este método baseia-se em diferentes aspectos do procedimento de imagem, desde a aquisição à análise, para otimizar a confiabilidade, reprodutibilidade, a dependência não-usuário, e significância estatística. Um índice de bioluminescência quantificação é atribuído a cada rato; este valor, que nós chamamos uma luminoscore, pode ser comparado não apenas entre animais, mas alassim entre os experimentos.
Neste trabalho, vamos nos concentrar no procedimento de imagem de bioluminescência, bem como a quantificação imagem pelo método luminoscore. Mostramos a eficácia deste método para verificar a injeção, monitorando a carga tumoral, e avaliar a eficácia de no tratamento do câncer situ. Cada um destes pontos é ilustrado nos resultados representativos das experiências utilizando diferentes modelos de ratinho para realçar a capacidade de adaptação do método luminoscore.
A absorção da luz por órgãos e tecidos permanece uma limitação de imagem de bioluminescência, embora esta limitação é intrínseco a qualquer modalidade de imagem óptica. No âmbito da nossa abordagem, espera-se que os efeitos de estruturas anatómicas no luminoscore ter baixa variabilidade, desde que os estudos são realizados num determinado modelo (localização e Strand rato), permitindo, em seguida, as comparações. A bioluminescência não precisa de luz de excitação e, portanto, é mais adaptada ao corpo inteiro in vivo de imagens de fluorescência.
A resolução espacial é também uma limitação de imagem de bioluminescência e localização precisa do órgão a partir do qual são emitidos fotões bioluminescência continua a ser difícil. No entanto, um bom conhecimento do modelo pode ajudar na localização qualitativa dos locais tumorais. A única saída no presente método à base de bioluminescência é o luminoscore. Localização não influencia a luminoscore porque o mark-up Região Manual de Interest (ROI) cobre todo o mouse. Finalmente, firefly luciferase requer oxigênio. Assim, imagem de bioluminescência normalmente subestima tumores necrosados. Mais uma vez, um bom conhecimento deste aspecto do modelo é necessária.
Neste trabalho, não estamos com o objetivo de avaliar a eficácia de CpG como uma droga anti-tumor (que já foi demonstrado 7,9,11), mas para descrever um método permitindo a comparação de conjuntos de dados de bioluminescência. Nós, de facto descrever um método para quantificar a carga tumoral destina-se a ajudar a padronizar o protocolo de aquisição para a comparação de diferentes ensaios em locais diferentes em momentos diferentes e que não necessita de cálculos de computador. Para garantir a reprodutibilidade e a quantificação de fluxo de fótons correcto, o dispositivo de imagem deve ser calibrado com uma luz de referência para os dispositivos caseiros ou como recomendado pelo fornecedor para dispositivos comerciais.
Nosso protocolo requer muita atenção a vários p críticaoints: (i) Em primeiro lugar, a qualidade da anestesia rato é crucial para a obtenção de imagens claras, especialmente nos casos com tempos de exposição longos. (Ii) A unidade de quantificação deve ser sempre ser o fluxo de fótons por radiação depende da área de superfície de cada murganho e pode ser irrelevante para a comparação de ratos diferentes. (Iii) As imagens bioluminescência não deve conter pixels saturados, porque estes distorceria o luminoscore. (iv) Voltar e aquisição de frente são obrigados a recolher todos os fótons emitidos a partir do local do tumor (ou seja, a aquisição da frente pode não necessariamente detectar fótons da parte de trás do tumor). Vários desenhos ROI diferentes foram testadas durante o desenvolvimento do método de luminoscore. Apenas o manual marca-se resultados satisfatórios, que são mais susceptíveis de ser estatisticamente significativo (dados não apresentados).
Inoue et al. recomendar uma dose luciferina de 75 mg / kg 13. Ao utilizar uma dose de 150 mg / kg em vez disso, o tempo de imagiologia após oadministração luciferina permanece inalterado e podemos garantir que o planalto dura toda uma aquisição de exposição a longo. Luciferina deve ser o excesso de reagente durante todo o processo de aquisição. Dependendo do modelo, da região de interesse pode ser adaptada, como se mostrou no modelo SCL onde se extraiu duas ROI por animal. No modelo SCL, o tratamento é injectado quando o tumor atinge 0,5 cm na sua maior diâmetro para limitar a variabilidade do enxerto. Dependendo dos murganhos, o tumor pode ter crescido de forma diferente. Para padronizar e comparar ratos, decidimos utilizar uma relação entre o lado tratado e não-tratado que revela o crescimento relativo de ambos os tumores flancos.
Se nenhum sinal for observada a partir de um ratinho injectado deverá ser positivo, ou (i) o número de células é muito baixo e o sinal está abaixo do limite de detecção; ou (ii) o mouse não tem oxigênio e exige cuidados imediatos.
Vários dos bioluminesc quantitativaAs análises cia descrita por vários autores requerem cálculos complexos e instrumentos (por exemplo, tomografia bioluminescência 3D) para abordar a quantificação absoluta de fótons emitidos bioluminescência 5,15. Não há consenso sobre um método para quantificação de bioluminescência reprodutível, especialmente em modelos de tumores, com um gerador de imagens bioluminescência 2D. Nosso objetivo foi padronizar o protocolo de aquisição de imagem para limitar user-dependência.
A injecção de CpG in situ após a inoculação do tumor reduziu a carga de tumor em ambos os modelos. O método luminoscore pode servir como uma ferramenta para monitorizar a carga tumoral em outros modelos de imunoterapia de tumor. Monitorando a carga do tumor proporciona um método não invasivo que pode melhorar a nossa compreensão dos mecanismos de crescimento tumoral e metastização, sem interferir com o microambiente do tumor. A identificação dos animais e que fazem não respondem ao tratamento com este método é reforçado pela verificação de sinjecção das células tumorais uccessful no início da experiência.
Nós aqui mostrou a adaptabilidade do método luminoscore num modelo SCL usando células A20.IIA-luc2. No entanto, este método pode ser adaptado a qualquer outro modelo de tumor utilizando outras linhas de células, desde que expressam a luciferase, ou no contexto de estudos de células T (células T citotóxicas específicas de tumores, as células T reguladoras, etc.). A monitorização in vivo da transferência do gene no contexto da terapia genética de doenças raras, também poderia ser feita utilizando o método luminoscore.
Finalmente os dados mostram que o método luminoscore à base de bioluminescência permite a comparação entre os experimentos, oferece flexibilidade e adaptabilidade às necessidades específicas experimental, e é uma ferramenta útil para estudos pré-clínicos longitudinais não-invasivos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos às instalações animais do Centro de Pesquisa Cordelier (CEF, Paris, França), Généthon (Evry, França) e Genopole (CERFE, Evry, França). Agradecemos Jo Ann Cahn para sua leitura cuidadosa do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelo Institut National de la Santé Et de la Rechercher Médicale, Paris Descartes University, Pierre & Marie Curie University, a Association pour la Recherche contre le Cancer, a Direcção da Tunísia Générale de la Recherche Scientifique, CMCU o franco-tunisino projeto e as ações Thématiques Incitatives de Genopole fundos (ATIGE). JC foi apoiada pelos Fronteiras em Ciências da Vida escola de doutorado e por uma bolsa do INCA (Instituto Nacional do Câncer du). RBA foi um destinatário de doações da DGRS-INSERM eo CMCU. SD recebeu uma bolsa do Institut National Cancer du.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
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ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
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D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
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Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |