التصوير تلألؤ بيولوجي هو أداة معروفة لتوطين الأورام والانبثاث، ولكن القياس الكمي لهذه الصور وغالبا ما يتطلب عمليات حسابية معقدة وأدوات معينة. نحن تصف طريقة luminoscore سهلة الاستخدام، على أساس شروط اكتساب دقيقة، لا تتطلب حسابات، وتمكين عبء الورم والاستجابة للعلاج التي يتعين رصدها في نماذج الفئران.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
يبقى الكشف المبكر عن الخلايا السرطانية تحديا وأمر حاسم لتعزيز فعالية علاج السرطان. في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي التصوير (BLI) هي حساسة للغاية، تقنية البصرية موسع، وتستخدم على نطاق واسع لرصد الأورام في الحيوانات الصغيرة. تستخدم اليراع الخلايا، معربا عن وسيفيراز عادة لمثل هذه التجارب 1،2. هذا أوكسيجيناز يكسد-D وسيفيرين مع الأكسجين الجزيئي ولكن يتطلب اثنين من العوامل المساعدة – المغنيسيوم 2+ وأدينوسين ثلاثي الفوسفات 3. اليراع وسيفيراز هو أكثر ملاءمة للتصوير في الجسم الحي من renilla وسيفيراز 4 لأن الغلة الكم أعلى.
الركيزة أكسدة – oxyluciferin – تنبعث من تلقاء أنفسهم فوتون للعودة إلى الدولة الأساسية ومن ثم تصبح غير نشطة. الفوتونات المنبعثة يكون الحد الأقصى لطول موجة حوالي 530 نانومتر. ويمكن للكاميرا عالية الحساسية للكشف عن الفوتونات الانارة من الداخل من الحيوانات الصغيرة، وتوفير الصور التي تجعل من POSSible لتحديد موقع الخلايا السرطانية.
القدرة على تحديد عبء الورم بدقة التهم الفوتون يمكن أن يكون بمثابة أداة قوية وحساسة لقياس فعالية العلاج. لأن آثار العلاج يمكن أن يتم الكشف عاجلا، هذه الحساسية قد تجعل من الممكن تحديد اللحظة الدقيقة التي تصبح فيها العلاج الفعال.
الكمي المطلق من إجمالي الفوتونات المنبعثة معقد جدا. يعتمد عدد الفوتونات التي تم جمعها على عمق الورم وعلى الأعضاء وتنبعث الفوتونات من خلال. ويمكن حساب معامل التصحيح بناء على معاملات امتصاص الأنسجة 5، ولكن الكمي المطلق من أعداد الخلايا السرطانية يتطلب معرفة عدد الفوتونات المنبعثة من كل الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، التعبير وسيفيراز، مثلها في ذلك مثل العديد من الجينات مراسل (على سبيل المثال، البروتينات الفلورية) ليست متجانسة، حتى في السكان الخلية المستمدة من استنساخ واحد (6). عدد إبليسلا يمكن أن تحسب البروتينات بورصة عمان في الخلايا بالضبط. تهيئة الظروف التجريبية الموحدة وهكذا يبدو حاسما لتحليل موثوق نصف الكمية.
طبقنا طريقة luminoscore لاثنين من نماذج مختلفة اللمفاوية للفئران 7،8،9. في هذه النماذج، يتم حقن الخلايا السرطانية مسانج في العين أو تحت الجلد للحصول على التوالي، وسرطان الغدد الليمفاوية العين (PIOL) النموذج الأولي وسرطان الغدد الليمفاوية تحت الجلد (SCL) نموذج. في كل من هذه النماذج مثلي، يدار العلاج في الوضع الطبيعي، بعد سبعة أيام من التلقيح الورم لPIOL وعندما وصلت الورم 0،5-0،7 سم في أكبر قطرها عن SCL.
استخدمنا طريقة luminoscore لرصد آثار الموقع العلاج الدليل السياسي الشامل، والتي تظهر سابقا أن تكون فعالة 7،10،11. الدليل السياسي الشامل هو تسلسل قليل النوكليوتيد ويجند من TLR9، والذي بدوره هو مستقبلات الخلايا التي عبرت عنها العديد مLLS الجهاز المناعي، بما في ذلك الخلايا الجذعية، الخلايا الليمفاوية B، وحيدات، والخلايا القاتلة الطبيعية. الدليل السياسي الشامل الحمض النووي هو 20 مير تسلسل الحمض النووي الذي يحتوي على الدليل السياسي الشامل (CG) عزر يمونوستيمولاتوري. المراقبة (ODN السيطرة) هو نفسه 20 مير تسلسل الحمض النووي، إلا أن تسلسل CG يمونوستيمولاتوري هو مقلوب (GC). مشاركة TLR9 في الغدد الليمفاوية الفئران نحن ندرس يستحث موت الخلايا المبرمج 10، ينشط الجهاز المناعي 12، وبالتالي يخفف كثيرا من عبء الورم 7،11.
نحن هنا وصف طريقة معيارية لقياس عبء الورم والاستجابة للعلاج من خلال الصور إضاءة الحيوية. ويعتمد هذا الأسلوب على جوانب مختلفة من إجراء التصوير، من الاستحواذ على التحليل، لتحسين الموثوقية، استنساخ، والاعتماد غير مستخدم، ودلالة إحصائية. ويعزى مؤشر تلألؤ بيولوجي الكمي إلى كل فأر. ، ويمكن مقارنة هذه القيمة، الذي نسميه luminoscore ليس فقط بين الحيوانات ولكن اللهحتى بين التجارب.
في هذا العمل، ونحن نركز على إجراء التصوير تلألؤ بيولوجي فضلا عن تقدير صورة من طريقة luminoscore. نقدم لك مجموعة من فعالية هذه الطريقة للتحقق من الحقن، ورصد عبء الورم، وتقييم فعالية علاج السرطان الموقع في. ويتضح من كل هذه النقاط في نتائج ممثلة من التجارب باستخدام نماذج الماوس المختلفة لتسليط الضوء على التكيف من طريقة luminoscore.
امتصاص الضوء من قبل الأعضاء والأنسجة يبقى وجود قيود على التصوير تلألؤ بيولوجي، على الرغم من أن هذا التحديد متأصل في أي طريقة التصوير الضوئي. في سياق نهجنا، ومن المتوقع أن يكون تقلب منخفض شريطة أن يتم إجراء دراسات في نموذج معين (الموقع وحبلا الماوس)، مما يسمح للثم مقارنات آثار الهياكل التشريحية على luminoscore. تلألؤ بيولوجي لا يحتاج ضوء الإثارة، وبالتالي هو أكثر تتكيف مع الجسم كله في التصوير المجراة من مضان.
التحليل المكاني هو أيضا وجود قيود على التصوير تلألؤ بيولوجي، ويبقى الموقع الدقيق للجهاز من التي تنبعث الفوتونات تلألؤ بيولوجي الصعب. ومع ذلك، معرفة جيدة من نموذج يمكن أن تساعد في الموقع النوعي للمواقع الأورام. الناتج الوحيد في هذه الطريقة على أساس تلألؤ بيولوجي هو luminoscore. الموقع لا تؤثر على luminoscore لأن علامة المتابعة اليدوية منطقة الاجتذاب الأموالر (ROI) ويشمل الماوس كله. وأخيرا، يراعة وسيفيراز تتطلب الأوكسجين. وفقا لذلك، والتصوير تلألؤ بيولوجي عادة يقلل الأورام الميتة. مرة أخرى، لا بد من معرفة جيدة لهذا الجانب من النموذج.
في هذه الورقة، ونحن لا تهدف إلى تقييم فعالية الدليل السياسي الشامل باعتباره دواء مضاد للأورام (الذي سبق أن أثبتت 7،9،11) ولكن لوصف طريقة السماح للمقارنة بين مجموعات البيانات تلألؤ بيولوجي. وصفنا في الواقع وسيلة لقياس عبء ورم تهدف الى المساعدة في توحيد بروتوكول الاستحواذ لمقارنة فحوصات مختلفة في أماكن مختلفة في أوقات مختلفة، والتي لا تتطلب حسابات الكمبيوتر. لضمان استنساخ والصحيح الكمي الفوتون تدفق، ويجب معايرة جهاز التصوير مع إشارة ضوئية لأجهزة محلية الصنع أو على النحو الموصى به من قبل مزود لأجهزة التجارية.
يتطلب بروتوكول اهتمامنا دقيق لعدة ص حرجةoints: (ط) أولا، ونوعية التخدير الماوس أمر حاسم للحصول على صور واضحة، خصوصا في الحالات مع أوقات التعرض الطويل. (ب) يجب أن تكون وحدة القياس الكمي دائما أن يكون تدفق الفوتون لإشعاع يعتمد على مساحة كل فأر وقد تكون في غير محلها لمقارنة الفئران مختلفة. (ج) يجب أن لا يحتوي الصور تلألؤ بيولوجي بكسل المشبعة، لأن هذه من شأنه انحياز luminoscore. (د) يطلب العودة واكتساب الأمامي لجمع كل الفوتونات المنبعثة من موقع الورم (أي اكتساب الأمامي قد لا يكشف بالضرورة الفوتونات من الجزء الخلفي من ورم). تم اختبار العديد من الرسومات العائد على الاستثمار المختلفة خلال تطوير أسلوب luminoscore. فقط دليل علامة المتابعة أثمرت نتائج مرضية التي يرجح أن تكون ذات دلالة إحصائية (لا تظهر البيانات).
اينو وآخرون. يوصي جرعة وسيفيرين من 75 ملغم / كغم 13. باستخدام جرعة 150 ملغم / كغم بدلا من ذلك، فإن توقيت التصوير بعدلا تزال إدارة وسيفيرين دون تغيير، وعلينا أن نضمن أن الهضبة تدوم طوال اكتساب التعرض لفترة طويلة. يجب أن يكون وسيفيرين المتفاعلة الزائدة طوال عملية الاستحواذ. اعتمادا على نموذج، المنطقة ذات الاهتمام يمكن تكييفها، كما فعلنا في نموذج SCL حيث تعادلنا اثنين من العائد على الاستثمار لكل حيوان. وفي نموذج SCL، يتم حقن العلاج عندما يصل الورم 0.5 سم في أكبر قطر للحد من التقلبات من engraftment. اعتمادا على الفئران، والورم قد نمت بشكل مختلف. لتوحيد ومقارنة الفئران، قررنا استخدام النسبة بين الجانب المعالج وغير المعالجة التي تكشف عن النمو النسبي لكلا الجناحين الأورام.
إذا لوحظ أي إشارة من الماوس حقن المتوقع أن تكون إيجابية، إما (ط) عدد الخلايا منخفض جدا وإشارة أقل من عتبة الكشف. أو (ب) الماوس يفتقر إلى الأكسجين ويتطلب عناية فورية.
العديد من bioluminesc الكميةسينعقد التحليلات التي وصفها الكتاب المختلفة تتطلب حسابات معقدة وأدوات (على سبيل المثال، 3D التصوير المقطعي تلألؤ بيولوجي) للاقتراب من تقدير المطلق من الفوتونات المنبعثة تلألؤ بيولوجي 5،15. لا يوجد إجماع على طريقة لقياس تلألؤ بيولوجي بتكاثر، خصوصا في نماذج الورم، مع تصوير تلألؤ بيولوجي 2D. كان هدفنا هو توحيد بروتوكول الحصول على الصور للحد من المستخدمين الاعتماد.
حقن الدليل السياسي الشامل في الموقع بعد التلقيح الورم خفض عبء الورم في كلا النموذجين. طريقة luminoscore يمكن أن تكون بمثابة أداة لمراقبة عبء الورم في نماذج أخرى من المناعية الورم. مراقبة عبء الورم يوفر طريقة موسع التي يمكن أن تحسن فهمنا لنمو الورم وآليات نقيلي دون التدخل في المكروية الورم. ويتعزز تحديد الحيوانات التي تفعل ولا تستجيب للعلاج بهذه الطريقة من قبل التحقق من الصورةuccessful حقن الخلايا السرطانية في بداية التجربة.
نحن هنا أظهر القدرة على التكيف من طريقة luminoscore في نموذج SCL باستخدام خلايا A20.IIA-luc2. ومع ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة لأي نموذج الورم الآخرين الذين يستخدمون خطوط الخلايا الأخرى بشرط أن التعبير عن وسيفيراز، أو في سياق الدراسات خلايا T (ورم محددة الخلايا التائية السامة للخلايا والتنظيمية خلايا تي، وما إلى ذلك). ويمكن أيضا أن يتم رصد في الجسم الحي نقل الجينات في سياق العلاج الجيني لمرض نادر باستخدام طريقة luminoscore.
أخيرا تظهر البيانات أن طريقة luminoscore القائم على تلألؤ بيولوجي يمكن المقارنة بين التجارب، ويوفر المرونة والقدرة على التكيف مع احتياجات تجريبية محددة، ويشكل وسيلة مفيدة لدراسات ما قبل السريرية طولية موسع.
The authors have nothing to disclose.
نشكر مرافق الحيوانية من مركز كوردولييه البحوث (مركز دراسات الحدود، باريس، فرنسا)، Genethon (إيفري، فرنسا) وGenopole (CERFE، إيفري، فرنسا). نشكر جو آن كاهن لها قراءة متأنية للمخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني للسانتيه إت دي لا Rechercher ميديكال، جامعة باريس ديكارت، بيار وماري جامعة كوري، جمعية صب لا بحوث مناهضة جنيه السرطان، والاتجاه التونسي جنرال للبحوث العلميه، CMCU فرانكو التونسي المشروع، وتطبيقات Thématiques Incitatives دي Genopole (ATIGE) الأموال. وأيد JC من حدود في مدرسة علوم الحياة الدكتوراه والزمالة من الإنكا (المعهد الوطني للسرطان). وكان بنك الاحتياطي الأسترالي المستفيدة من المنح المقدمة من DGRS-INSERM وCMCU. تلقى SD منحة من المعهد الوطني للسرطان.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |