l'imaging bioluminescenza è uno strumento ben noto per la localizzazione di tumori e metastasi, ma la quantificazione di queste immagini spesso richiede calcoli complessi e particolari strumenti. Descriviamo il metodo luminoscore da usare facile, in base alle condizioni di acquisizione precise, che non richiede calcoli e permette il carico tumorale e della risposta al trattamento da monitorare in modelli murini.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
Rilevamento delle cellule tumorali precoce rimane una sfida ed è fondamentale per migliorare l'efficacia del trattamento del cancro. In vivo l'imaging bioluminescenza (BLI) è una tecnica non invasiva ottica molto sensibile, ampiamente utilizzato per il monitoraggio di tumori nei piccoli animali. Cellule che esprimono luciferasi Firefly sono comunemente usati per tali esperimenti 1,2. Questo ossigenasi ossida D-luciferina con ossigeno molecolare, ma richiede due cofattori – Mg 2+ e adenosina trifosfato 3. Lucciola luciferasi è più adatto per l'imaging in vivo di renilla luciferasi 4 perché la resa quantica è maggiore.
Il substrato ossidato – oxyluciferin – emette spontaneamente un fotone di ritornare al suo stato fondamentale e quindi diventa inattivo. I fotoni emessi hanno una lunghezza d'onda massima circa 530 nm. Una telecamera ad alta sensibilità in grado di rilevare i fotoni luminescenti dall'interno di un piccolo animale e fornire immagini che rendono possbile per individuare le cellule tumorali.
La capacità di quantificare il carico tumorale con precisione da conteggi di fotoni potrebbe servire come uno strumento potente e sensibile per quantificare l'efficacia del trattamento. Poiché gli effetti del trattamento possono essere rilevate prima, questa sensibilità potrebbe consentire di determinare il momento esatto in cui un trattamento diventa efficace.
quantificazione assoluta del totale fotoni emessi è molto complessa. Il numero di fotoni raccolti dipende dalla profondità del tumore e sugli organi fotoni vengono emessi attraverso. Coefficienti di correzione in base ai coefficienti di assorbimento dei tessuti possono essere calcolati 5, ma la quantificazione assoluta del numero di cellule tumorali richiede conoscere il numero di fotoni emessi da ciascuna delle cellule tumorali. Inoltre, l'espressione della luciferasi, come quella di molti geni reporter (ad es., Proteine fluorescenti) non è omogenea, anche in una popolazione di cellule derivate da un singolo clone 6. Il numero di Luciferoproteine ASE nelle cellule non possono essere calcolati esattamente. La creazione di condizioni sperimentali standardizzate appare quindi cruciale per una affidabile analisi semi-quantitativa.
Abbiamo applicato il metodo luminoscore a due diversi modelli di linfoma di topo 7,8,9. In questi modelli, cellule tumorali singenici vengono iniettate nell'occhio o sotto la pelle per ottenere rispettivamente modello, un modello primario linfoma intraoculare (PIOL) e un linfoma sottocutaneo (SCL). In ciascuno di questi modelli ortotopico, il trattamento viene somministrato in situ, sette giorni dopo l'inoculazione del tumore per PIOL e quando il tumore ha raggiunto 0,5 a 0,7 cm di suo più grande diametro per SCL.
Abbiamo usato il metodo luminoscore per monitorare gli effetti della terapia で situ CpG, precedentemente dimostrato di essere efficace 7,10,11. CpG è una sequenza oligonucleotide e un ligando di TLR9, che a sua volta è un recettore intracellulare espressa da numerosi ceLLS del sistema immunitario, comprese le cellule dendritiche, linfociti B, monociti e cellule natural killer. CpG-DNA è una sequenza di DNA di 20-mer che contiene il CpG (CG) motivo immunostimolante; il controllo (ODN-control) è la stessa sequenza di DNA 20-mer, ma la sequenza CG immunostimolante è invertita (GC). Impegno TLR9 nel linfoma murino stiamo studiando induce apoptosi 10, attiva il sistema immunitario 12, e quindi riduce in modo significativo tumore onere 7,11.
Qui si descrive un metodo standardizzato per quantificare il carico tumorale e della risposta al trattamento attraverso le immagini bioluminescenti. Questo metodo si basa su diversi aspetti della procedura di imaging, dall'acquisizione all'analisi, per ottimizzare affidabilità, riproducibilità, la dipendenza non utente e significatività statistica. Un indice bioluminescenza quantificazione è attribuito a ogni mouse; questo valore, che noi chiamiamo un luminoscore, può essere paragonato, non solo tra gli animali, ma alcosì tra esperimenti.
In questo lavoro, grazie alla procedura di imaging bioluminescenza, nonche la quantificazione immagine dal metodo luminoscore. Mostriamo l'efficacia di questo metodo per verificare l'iniezione, monitoraggio carico tumorale, e valutare l'efficacia di un trattamento del cancro in situ. Ciascuno di questi punti è illustrato nei risultati rappresentativi da esperimenti utilizzando diversi modelli murini di evidenziare l'adattabilità del metodo luminoscore.
L'assorbimento della luce da organi e tessuti rimane una limitazione di imaging bioluminescenza, anche se questa limitazione è intrinseco a qualsiasi modalità di imaging ottico. Nel contesto del nostro approccio, gli effetti delle strutture anatomiche sulla luminoscore dovrebbero avere bassa variabilità a condizione che gli studi sono effettuati in un dato modello (posizione e strand mouse), consentendo quindi il confronto. Bioluminescenza non ha bisogno di luce di eccitazione e quindi è più adatta a tutto il corpo imaging in vivo di fluorescenza.
La risoluzione spaziale è anche una limitazione delle immagini bioluminescenza, e la posizione precisa dell'organo da cui vengono emessi i fotoni bioluminescenza rimane difficile. Tuttavia, una buona conoscenza del modello può aiutare nella posizione qualitativa dei siti tumorali. L'unica uscita in questo metodo bioluminescenza basata è la luminoscore. Posizione non influenza il luminoscore perché il mark-up manuale Regione di Interest (ROI) copre l'intera mouse. Infine, lucciola luciferasi richiede ossigeno. Di conseguenza, l'imaging bioluminescenza di solito sottovaluta tumori necrotici. Ancora una volta, è richiesta una buona conoscenza di questo aspetto del modello.
In questo lavoro, non stiamo volto a valutare l'efficacia di CpG come un farmaco anti-tumorale (che è già stato dimostrato 7,9,11), ma per descrivere un metodo che permette il confronto dei dataset bioluminescenza. Abbiamo infatti descrive un metodo per quantificare il carico tumorale destinato ad aiutare standardizzare il protocollo di acquisizione per il confronto di diversi saggi in luoghi diversi in momenti diversi e che non richiede calcoli del computer. Per garantire la riproducibilità e la corretta quantificazione flusso di fotoni, il dispositivo di imaging deve essere calibrato con un riferimento chiaro per i dispositivi fatti in casa o come raccomandato dal fornitore per i dispositivi commerciali.
Il nostro protocollo richiede attenzione a diversi p criticaoints: (i) In primo luogo, la qualità dell'anestesia mouse è fondamentale per ottenere immagini nitide, specialmente nei casi con lunghi tempi di esposizione. (Ii) L'unità quantificazione deve essere sempre il flusso di fotoni perché radianza dipende dalla superficie di ciascun topo e potrebbe essere irrilevante per confrontare topi differenti. (Iii) Le immagini bioluminescenza non devono contenere pixel saturi, perché questi avrebbe polarizzare il luminoscore. (iv) Di nuovo ed acquisizione anteriore sono tenuti a raccogliere tutti i fotoni emessi dal sito tumorale (cioè, l'acquisizione anteriore non può necessariamente rilevare fotoni dal retro del tumore). Vari disegni ROI diversi stati testati durante lo sviluppo del metodo luminoscore. Solo l'uso mark-up dato risultati soddisfacenti che hanno maggiori probabilità di essere statisticamente significativo (dati non mostrati).
Inoue et al. raccomanda una dose luciferina di 75 mg / kg 13. Usando una dose di 150 mg / kg, invece, la tempistica delle immagini dopo laamministrazione luciferina rimane invariato e si assicurano che l'altopiano dura per tutta una acquisizione esposizione a lungo. Luciferin deve essere il reagente in eccesso durante il processo di acquisizione. A seconda del modello, la regione di interesse può essere adattato, come abbiamo mostrato nel modello SCL dove abbiamo disegnato due ROI per animale. Nel modello SCL, il trattamento viene iniettato quando il tumore raggiunge 0,5 cm nella sua grande diametro per limitare variabilità di attecchimento. A seconda dei topi, il tumore potrebbe aver cresciuto diverso. Per uniformare e confrontare i topi, abbiamo deciso di utilizzare un rapporto tra lato trattato e non trattato che rivela la crescita relativa di entrambi i tumori fianchi.
Se nessun segnale viene osservato da un mouse iniettato dovrebbe essere positivo, (i) il numero di cellule è molto basso e il segnale è al di sotto della soglia di rilevamento; o (ii) il mouse manca di ossigeno e richiede cure immediate.
Molti dei bioluminesc quantitativaza analisi descritto da vari autori richiedono calcoli complessi e strumenti (ad esempio, 3D bioluminescenza tomografia) per avvicinarsi alla quantificazione assoluta dei fotoni emessi bioluminescenza 5,15. Non c'è consenso su un metodo per quantificare bioluminescenza riproducibile, soprattutto nei modelli di tumore, con un imager 2D bioluminescenza. Il nostro obiettivo era quello di standardizzare il protocollo di acquisizione delle immagini per limitare user-dipendenza.
L'iniezione di CpG in situ dopo l'inoculazione del tumore riduce il carico tumorale in entrambi i modelli. Il metodo luminoscore può servire come strumento per monitorare il carico tumorale in altri modelli di immunoterapie tumorali. Monitoraggio carico tumorale fornisce un metodo non invasivo che può migliorare la nostra comprensione della crescita tumorale e metastasi meccanismi senza interferire con il microambiente tumorale. L'identificazione degli animali che fanno e non rispondono al trattamento con questo metodo è rafforzata dalla verifica della siniezione di cellule tumorali uccessful all'inizio dell'esperimento.
Abbiamo qui mostrato la capacità di adattamento del metodo luminoscore in un modello SCL utilizzando cellule A20.IIA-luc2. Tuttavia, questo metodo può essere adattato a qualsiasi altro modello di tumore usando altre linee cellulari condizione che esprimono luciferasi, o nell'ambito di studi cellule T (tumore specifica cellule T citotossiche, cellule T regolatorie, ecc). Il monitoraggio in vivo trasferimento genico nel contesto della terapia genica delle malattie rare potrebbe anche essere fatta usando il metodo luminoscore.
Infine i dati mostrano che il metodo luminoscore bioluminescenza-based permette il confronto tra esperimenti, offre flessibilità e adattabilità alle specifiche esigenze sperimentali, ed è uno strumento utile per non invasivi studi preclinici longitudinali.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo le strutture animali della Cordelier Research Center (CEF, Parigi, Francia), Genethon (Evry, Francia) e Genopole (CERFE, Evry, Francia). Ringraziamo Jo Ann Cahn per la sua attenta lettura del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal Institut National de la Santé et de la Rechercher Médicale, Paris Descartes University, Pierre & Marie Curie University, l'Associazione pour la Recherche contre le Cancer, la Direzione tunisina Générale de la Recherche Scientifique, CMCU franco-tunisina progetto e le azioni thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) fondi. JC è stata sostenuta dal Frontiers in Life Science scuola di dottorato e da una borsa di studio dal INCA (Istituto Nazionale del Cancro). RBA è stato un destinatario di sovvenzioni dal DGRS-INSERM e il CMCU. SD ha ricevuto una borsa di studio presso l'Institut National du Cancer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
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ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
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D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
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Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |