l'imagerie par bioluminescence est un outil bien connu pour la localisation de tumeurs et les métastases, mais la quantification de ces images nécessite souvent des calculs complexes et des instruments particuliers. Nous décrivons la méthode luminoscore-utilisation facile, en fonction des conditions d'acquisition précises, ne nécessitant pas de calculs, et en permettant la charge tumorale et la réponse au traitement à surveiller dans les modèles de souris.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
La détection des cellules tumorales précoce reste un défi et est crucial pour l' amélioration de l' efficacité du traitement du cancer. In vivo l' imagerie par bioluminescence (BLI) est une technique optique non invasive très sensible, largement utilisé pour les tumeurs de surveillance chez les petits animaux. Cellules luciférase exprimant Firefly sont couramment utilisés pour de telles expériences 1,2. Cette oxygénase oxydent D-luciférine avec de l' oxygène moléculaire , mais nécessite deux cofacteurs – Mg 2+ et adénosine triphosphate 3. Luciole luciférase est plus appropriée pour l' imagerie in vivo que la luciférase de Renilla 4 parce que son rendement quantique est plus élevé.
Le substrat oxydé – oxyluciférine – émet spontanément un photon pour revenir à son état fondamental, puis devient inactif. Les photons émis ont une longueur d'onde maximale d'environ 530 nm. Une caméra à haute sensibilité permet de détecter les photons luminescents à l'intérieur d'un petit animal et fournir des images qui en font possIble pour localiser les cellules tumorales.
La capacité de quantifier la charge tumorale avec précision par comptages de photons pourrait servir comme un outil puissant et sensible pour quantifier l'efficacité du traitement. Parce que les effets du traitement peuvent être détectés plus tôt, cette sensibilité peut permettre de déterminer le moment exact où un traitement devient efficace.
quantification absolue du nombre total de photons émis est très complexe. Le nombre de photons recueillis dépend de la profondeur de la tumeur et sur les organes les photons sont émis à travers. Les coefficients de correction sur la base des coefficients d'absorption du tissu peut être calculée 5, mais la quantification absolue du nombre de cellules tumorales nécessite de connaître le nombre de photons émis par chaque cellule tumorale. En outre, l' expression de la luciférase, comme celle de nombreux gènes rapporteurs (par exemple., Les protéines fluorescentes) n'est pas homogène, même dans une population de cellules provenant d'un seul clone 6. Le nombre de luciferprotéines ase dans les cellules ne peuvent pas être calculées exactement. La mise en place des conditions expérimentales normalisées apparaît donc cruciale pour une analyse semi-quantitative fiable.
Nous avons appliqué la méthode de luminoscore à deux modèles différents de lymphome de souris 7,8,9. Dans ces modèles, les cellules tumorales syngéniques sont injectées dans l'oeil ou sous la peau pour obtenir respectivement un premier modèle de lymphome intra-oculaire (PIOL) et un lymphome sous-cutané (SCL) modèle. Dans chacun de ces modèles orthotopiques, le traitement est administré in situ, sept jours après l'inoculation de la tumeur pour PIOL et quand la tumeur a atteint 0,5 à 0,7 cm dans son plus grand diamètre pour SCL.
Nous avons utilisé la méthode de luminoscore pour surveiller les effets de la thérapie in situ CpG dans, précédemment montré pour être efficace 7,10,11. CpG est une séquence d'oligonucléotide et un ligand du TLR9, ce qui est un récepteur intracellulaire exprimé par de nombreuses CEIIs du système immunitaire, notamment les cellules dendritiques, les lymphocytes B, les monocytes et les cellules tueuses naturelles. CpG ADN est une séquence d'ADN 20-mère contenant le CpG (CG) du motif immunostimulateur; le contrôle (ODN-control) est la même séquence d'ADN 20-mer, sauf que la séquence CG immunostimulante est inversé (GC). Engagement TLR9 dans le lymphome murin nous étudions induit l' apoptose 10, active le système immunitaire 12, et ainsi réduit de manière significative la charge tumorale 7,11.
Nous décrivons ici une méthode normalisée pour quantifier la charge tumorale et la réponse au traitement à travers des images bioluminescentes. Cette méthode repose sur différents aspects de la procédure d'imagerie, de l'acquisition à l'analyse, afin d'optimiser la fiabilité, la reproductibilité, la dépendance non-utilisateur, et la signification statistique. Un indice bioluminescence de quantification est attribué à chaque souris; cette valeur, que nous appelons un luminoscore, peut être comparé non seulement entre les animaux, mais aldonc entre les expériences.
Dans ce travail, nous nous concentrons sur la procédure d'imagerie par bioluminescence, ainsi que l'image de quantification par la méthode luminoscore. Nous montrons l'efficacité de cette méthode de contrôle de l'injection, la surveillance de la charge tumorale et l' évaluation de l'efficacité du traitement du cancer in situ. Chacun de ces points est illustré dans les résultats représentatifs des expériences en utilisant différents modèles de souris pour mettre en évidence la capacité d'adaptation de la méthode de luminoscore.
absorption de la lumière par les organes et les tissus reste une limitation de l'imagerie par bioluminescence, bien que cette limitation est intrinsèque à toute modalité d'imagerie optique. Dans le cadre de notre approche, les effets des structures anatomiques sur le luminoscore devraient avoir une faible variabilité à condition que les études sont réalisées dans un modèle donné (emplacement et brin de la souris), ce qui permet ensuite des comparaisons. Bioluminescence n'a pas besoin de lumière d'excitation et est donc plus adapté à tout le corps dans l' imagerie in vivo de la fluorescence.
La résolution spatiale est également une limitation de l'imagerie par bioluminescence, et l'emplacement précis de l'organe à partir de laquelle les photons sont émis bioluminescence reste difficile. Cependant, une bonne connaissance du modèle peut aider à la localisation qualitative des sites tumoraux. La seule sortie de cette méthode basée bioluminescence-est le luminoscore. Lieu n'influence pas la luminoscore parce que la majoration manuelle Région de Interest (ROI) couvre toute la souris. Enfin, la luciférase de luciole a besoin d'oxygène. En conséquence, l'imagerie par bioluminescence sous-estime généralement des tumeurs nécrosées. Encore une fois, une bonne connaissance de cet aspect du modèle est nécessaire.
Dans cet article, nous ne cherchons pas à évaluer l'efficacité des CpG comme un médicament anti-tumoral (qui a déjà été démontré 7,9,11) , mais de décrire une méthode permettant de comparer les ensembles de données de bioluminescence. Nous décrivons en effet une méthode pour quantifier la charge tumorale destiné à aider normaliser le protocole d'acquisition pour comparer différents dosages dans des endroits différents à des moments différents et qui ne nécessite pas de calculs informatiques. Pour assurer la reproductibilité et la quantification correcte du flux de photons, le dispositif d'imagerie doit être étalonné avec une lumière de référence pour les appareils faits maison ou comme recommandé par le fournisseur pour les appareils commerciaux.
Notre protocole exige une attention particulière à plusieurs p critiquesoints: (i) d'abord, la qualité de l'anesthésie de la souris est cruciale pour obtenir des images claires, en particulier dans les cas de longues durées d'exposition. (Ii) L'unité de quantification doit être toujours le flux de photons, car le rayonnement dépend de la surface spécifique de chaque souris, et peut-être pas pertinent pour comparer les différentes souris. (Iii) Les images de bioluminescence ne doivent pas contenir des pixels saturés, car ceux-ci fausserait le luminoscore. (iv) Retour et l' acquisition avant sont tenus de recueillir tous les photons émis par le site de la tumeur (ie, l' acquisition avant peut ne pas détecter nécessairement photons à l'arrière de la tumeur). Divers différents dessins de retour sur investissement ont été testés lors de l'élaboration de la méthode de luminoscore. Seul le manuel mark-up a donné des résultats satisfaisants qui sont plus susceptibles d'être statistiquement significative (données non présentées).
Inoue et al. recommande une dose de luciférine de 75 mg / kg 13. En utilisant une dose de 150 mg / kg au lieu, le moment de l'imagerie après lel'administration de luciférine reste inchangé et nous assurer que le plateau dure toute une acquisition d'exposition à long. Luciferin doit être réactif en excès tout au long du processus d'acquisition. Selon le modèle, la région d'intérêt peut être adapté, comme nous l' avons montré dans le modèle SCL où nous avons tiré deux ROI par animal. Dans le modèle SCL, le traitement est injecté lorsque la tumeur atteint 0,5 cm dans son plus grand diamètre pour limiter la variabilité la prise de greffe. Selon les souris, la tumeur aurait grandi différemment. Afin d'uniformiser et de comparer les souris, nous avons décidé d'utiliser un rapport entre le côté traité et non traité qui révèle la croissance relative des deux tumeurs des flancs.
Si aucun signal est observé à partir d'une souris injectée devrait être positif, soit (i) le nombre de cellules est très faible et le signal est en dessous du seuil de détection; ou (ii) la souris manque d'oxygène et nécessite des soins immédiats.
Plusieurs des bioluminesc quantitativerence analyses décrit par divers auteurs exigent des calculs complexes et les instruments (par exemple, la tomographie par bioluminescence 3D) pour approcher la quantification absolue des photons de bioluminescence émis 5,15. Il n'y a pas de consensus sur une méthode de quantification bioluminescence reproductible, en particulier dans les modèles de tumeurs, avec une bioluminescence imageur 2D. Notre objectif était de normaliser le protocole d'acquisition d'image pour limiter l'utilisateur dépendance.
L'injection de CpG in situ après l' inoculation de la tumeur réduit la charge tumorale dans les deux modèles. La méthode de luminoscore peut servir d'outil pour surveiller la charge tumorale dans d'autres modèles de immunothérapies tumorales. La surveillance de la charge tumorale fournit une méthode non invasive qui peut améliorer notre compréhension de la croissance tumorale et les mécanismes métastatiques sans interférer avec le microenvironnement de la tumeur. L'identification des animaux qui ne sont et ne répondent pas au traitement par cette méthode est renforcée par la vérification de l'artl'injection de cellules tumorales uccessful au début de l'expérience.
Nous ici montré la capacité d'adaptation de la méthode de luminoscore dans un modèle SCL en utilisant des cellules A20.IIA-luc2. Cependant, cette méthode peut être adaptée à n'importe quel autre modèle de tumeur à l' aide d' autres lignées cellulaires à condition qu'elles expriment la luciférase, ou dans le cadre d'études de lymphocytes T (cellules T cytotoxiques spécifiques d'une tumeur, cellules T régulatrices, etc.). La surveillance in vivo de transfert de gènes で dans le contexte de la thérapie génique d' une maladie rare peut également être effectuée en utilisant la méthode de luminoscore.
Enfin, les données montrent que la méthode de luminoscore basée bioluminescence-permet des comparaisons entre les expériences, offre la flexibilité et l'adaptabilité aux besoins expérimentaux spécifiques, et est un outil utile pour les études précliniques longitudinales non invasives.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les installations pour les animaux du Centre de recherche Cordelier (CEF, Paris, France), Généthon (Evry, France) et Genopole (CERFE, Evry, France). Nous remercions Jo Ann Cahn pour sa lecture attentive du manuscrit. Cette recherche a été soutenue par l'Institut National de la Santé Et de la Rechercher Médicale, Université Paris Descartes, Université Pierre et Marie Curie, l'Association pour la Recherche contre le Cancer, la Direction tunisienne Générale de la Recherche Scientifique, CMCU franco-tunisien projet et les actions thematiques Incitatives de Genopole (ATIGE) fonds. JC a été soutenue par les frontières en sciences de la vie école doctorale et par une bourse de l'INCA (Institut National du Cancer). RBA a été récipiendaire de subventions de la DGRS-INSERM et l'CMCU. SD a reçu une subvention de l'Institut National du Cancer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
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ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
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D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
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Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |