Bioluminescentie beeldvorming is een bekend hulpmiddel voor het lokaliseren van tumoren en metastasen, maar kwantificering van deze beelden zijn vaak complexe berekeningen en bijzondere instrumenten. We beschrijven de easy-to-use luminoscore methode, gebaseerd op een nauwkeurige overname voorwaarden, vereist geen berekeningen, en het mogelijk maken tumorlast en de respons op de behandeling te kunnen houden in muismodellen.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
Vroege detectie van tumorcellen blijft een uitdaging en is van cruciaal belang voor het verbeteren van de behandeling van kanker werkzaamheid. In vivo bioluminescentie imaging (BLI) is een zeer gevoelig, niet-invasieve optische techniek op grote schaal gebruikt voor het bewaken van tumoren in kleine dieren. Vuurvlieg-luciferase tot expressie brengen worden gebruikt voor deze experimenten 1,2. Deze oxygenase oxideert D-luciferine met moleculaire zuurstof maar vereist twee cofactoren – Mg2 + en adenosine trifosfaat 3. Vuurvlieg luciferase is meer geschikt voor in vivo beeldvorming dan Renilla luciferase 4 omdat de kwantumopbrengst hoger.
Het geoxideerde substraat – oxyluciferine – emitteert een foton spontaan terugkeert naar zijn grondtoestand en inactief. De uitgezonden fotonen hebben een maximale golflengte rond 530 nm. De zeer gevoelige camera kan de luminescerende fotonen detecteren van de binnenkant van een klein dier en leveren beelden die zij maken mogbare tumorcellen lokaliseren.
De mogelijkheid om tumorlast nauwkeurig kwantificeren fotontellingen kan dienen als een krachtig en gevoelig middel voor het kwantificeren behandeling werkzaamheid. Omdat neveneffecten sneller kan worden gedetecteerd, kan deze gevoeligheid het mogelijk om het exacte moment waarop een behandeling ingaat bepalen.
Absolute kwantificering van totaal geëmitteerde fotonen is zeer complex. Het aantal fotonen verzameld afhankelijk van de diepte van de tumor en de organen van de fotonen worden door de uitgezonden. Correctiecoëfficiënten gebaseerd op weefselabsorptieplaats coëfficiënten worden berekend 5, maar de absolute kwantificering van tumorcel cijfers nodig weten het aantal fotonen door elk tumorcel. Bovendien luciferase expressie, zoals die van vele reportergenen (bijv., Fluorescerende eiwitten) niet homogeen, zelfs in een celpopulatie verkregen uit een enkele kloon 6. Het aantal luciferase eiwitten in cellen kan niet exact worden berekend. Om gestandaardiseerde experimentele omstandigheden lijkt dus cruciaal voor een betrouwbare semikwantitatieve analyse.
We pasten de luminoscore methode om twee verschillende muislymfoma modellen 7,8,9. In deze modellen worden syngene tumorcellen geïnjecteerd in het oog of onder de huid, een primaire intraoculaire lymfoom (PIOL) model en een subcutane lymfoom (SCL) model te verkrijgen, respectievelijk. In elk van deze orthotopische modellen, wordt de behandeling toegediend in situ, zeven dagen na de tumor-inoculatie voor PIOL en wanneer de tumor bereikt 0,5 tot 0,7 cm in zijn grootste diameter SCL.
We gebruikten de luminoscore methode om de effecten van で situ CpG behandeling te controleren, eerder aangetoond effectief 7,10,11 zijn. CpG is een oligonucleotide sequentie en een ligand van TLR9, die op zijn beurt een intracellulaire receptor door talrijke ce uitgedruktlls van het immuunsysteem, zoals dendritische cellen, B lymfocyten, monocyten en natuurlijke killer cellen. CpG-DNA is een 20-meer DNA-sequentie die de CpG (CG) immunostimulerende-motief bevat; de controle (ODN-control) gelijk is aan 20-meer DNA-sequentie, behalve dat het immunostimulerende sequentie CG geïnverteerd (GC). TLR9 engagement in het muizen lymfoom onderzoeken we induceert apoptose 10, activeert het immuunsysteem 12 en daardoor vermindert tumorlast 7,11.
Hier beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor het kwantificeren van de tumor lasten en respons op de behandeling door middel van bioluminescentie beelden. Deze methode is gebaseerd op verschillende aspecten van de beeldvorming procedure, van acquisitie tot analyse, om de betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid, non-user afhankelijkheid en statistische significantie te optimaliseren. Een bioluminescentie kwantificering index wordt toegeschreven aan elke muis; Deze waarde, die wij noemen luminoscore, vergelijkbaar niet alleen tussen dieren, maar aldus tussen de experimenten.
In dit werk, richten we ons op de bioluminescentie imaging procedure, alsmede het beeld kwantificering door de luminoscore methode. We tonen de effectiviteit van deze werkwijze voor het verifiëren van de injectie controle tumorlast, en beoordeling van de werkzaamheid van behandeling situ kanker. Elk van deze punten wordt geïllustreerd in representatieve resultaten van experimenten met verschillende muismodellen om het aanpassingsvermogen van de luminoscore methode te markeren.
Lichtabsorptie door de organen en weefsels is een beperking van bioluminescentie beeldvorming, hoewel deze beperking is inherent aan elke optische beeldvorming modaliteit. In het kader van onze benadering worden de effecten van anatomische structuren op de luminoscore wordt naar lage variabiliteit, voor zover dit onderzoek uit te voeren in een bepaald model (locatie en muis streng), waardoor vervolgens vergelijkingen. Bioluminescentie niet excitatie licht nodig en dus is meer aangepast aan het gehele lichaam in vivo beeldvorming dan fluorescentie.
Ruimtelijke resolutie is ook een beperking van bioluminescentie beeldvorming, en de precieze locatie van het orgaan waaruit bioluminescentie fotonen worden uitgestoten blijft moeilijk. Echter, goede kennis van het model helpen bij het kwalitatieve locatie van de tumor sites. De enige uitgang in deze bioluminescentie-gebaseerde methode is de luminoscore. Locatie heeft geen invloed op de luminoscore omdat de handmatige mark-up Regio Interest (ROI) bestrijkt het hele muis. Tenslotte vuurvlieg luciferase zuurstof nodig. Dienovereenkomstig, bioluminescentie beeldvorming onderschat meestal necrotische tumoren. Wederom wordt een goede kennis van dit aspect van het model vereist.
In dit document, zijn we niet de bedoeling de werkzaamheid van CpG als een anti-tumor drugs (reeds aangetoond 7,9,11), maar een werkwijze die een vergelijking van bioluminescentie datasets te beschrijven. We inderdaad een methode om tumorlast te helpen bij de acquisitie standaardiseren protocol voor het vergelijken van verschillende assays op verschillende plaatsen op verschillende tijdstippen kwantificeren beschrijven en die niet vereist computerberekeningen. Om de reproduceerbaarheid en correcte foton flux kwantificering te garanderen, moet de beeldvormende inrichting worden gekalibreerd met een lichte referentie voor zelfgemaakte apparaten of zoals aanbevolen door de provider voor commerciële apparaten.
Ons protocol vereist een zorgvuldige aandacht voor een aantal cruciale points: (i) eerste moet de kwaliteit van de muis anesthesie is cruciaal voor het verkrijgen van duidelijke beelden, vooral in gevallen met lange belichtingstijden. (Ii) Kwantificering apparaat altijd als fotonflux omdat straling afhangt van de oppervlakte van elke muis en irrelevant voor het vergelijken van verschillende muizen kunnen zijn. (Iii) De bioluminescentie afbeeldingen moeten niet verzadigde pixels bevatten, omdat deze zouden bias luminoscore. (iv) Voor- en achterkant verkrijgen moeten alle fotonen uitgezonden door de tumorplaats (dus front verkrijging niet noodzakelijkerwijs fotonen uit de achterkant van de tumor detecteren) verzamelt. Verschillende ROI tekeningen getest tijdens de ontwikkeling van de luminoscore methode. Alleen de handmatige verhoging bevredigend resultaat oplevert dat vaker statistisch significant te zijn (gegevens niet getoond).
Inoue et al. aan een luciferine dosis van 75 mg / kg 13. Door een dosis van 150 mg / kg in plaats daarvan het tijdstip van beeldvorming naluciferine administratie blijft onveranderd en wij zorgen ervoor dat het plateau duurt gedurende een lange overname blootstelling. Luciferine moet de overmaat reactant gedurende de acquisitie proces. Afhankelijk van het model, kan het gebied van belang worden aangepast, zoals we in het SCL model waar we trokken twee ROI per dier liet zien. In de SCL model wordt de behandeling ingespoten wanneer de tumor van 0,5 cm in zijn grootste diameter van de variabiliteit te beperken bereikt van engraftment. Afhankelijk van de muizen, de tumor kan anders zijn gegroeid. Standaardiseren en te vergelijken muizen besloten we een verhouding tussen behandelde en niet-behandelde zijde waar de relatieve groei van beide flanken tumoren onthult gebruiken.
Wanneer geen signaal wordt waargenomen vanaf een geïnjecteerde muis verwacht positief, hetzij (i) het aantal cellen is zeer laag en het signaal onder de detectiedrempel; of (ii) de muis ontbreekt zuurstof en vereist directe zorg.
Verscheidene van de kwantitatieve bioluminesclingen analyses beschreven door verschillende auteurs vereisen complexe berekeningen en instrumenten (bijvoorbeeld 3D bioluminescentie tomografie) om de absolute kwantificering van bioluminescentie uitgezonden fotonen 5,15 benaderen. Er is geen consensus over een methode voor het kwantificeren van bioluminescentie reproduceerbaar, vooral in de tumor modellen, met een 2D imager bioluminescentie. Ons doel was om het beeld overname protocol om user-afhankelijkheid te beperken standaardiseren.
De injectie van CpG in situ tumor-inoculatie verminderde tumorlast in beide modellen. De luminoscore methode kan dienen als een middel om tumorlast in andere modellen van tumor immuuntherapie te bewaken. Monitoring tumorlast verschaft een niet-invasieve methode die ons begrip van tumorgroei en metastasering mechanismen kunnen verbeteren zonder interferentie met de tumor micro-omgeving. De identificatie van de dieren die wel en niet reageren op een behandeling met deze methode wordt versterkt door de verificatie van de sUccessful injectie van tumorcellen aan het begin van het experiment.
We hier toonde het aanpassingsvermogen van de luminoscore methode in een SCL model met behulp van A20.IIA-luc2 cellen. Echter kan deze methode worden aangepast aan andere tumormodel op andere cellijnen mits luciferase expressie, of in de context van T-cel studies (tumorspecifieke cytotoxische T-cellen, regulerende T-cellen, enz.). De controle van in vivo genoverdracht in de context van gentherapie van zeldzame ziekte kan ook gebeuren met het luminoscore methode.
Tenslotte is de gegevens blijkt dat de bioluminescentie gebaseerde luminoscore methode maakt vergelijkingen tussen experimenten, biedt flexibiliteit en aanpasbaarheid aan de specifieke experimentele behoeften, en is een handig hulpmiddel voor niet-invasieve longitudinale preklinische studies.
The authors have nothing to disclose.
We danken het dier faciliteiten van het Cordelier Research Center (CEF, Parijs, Frankrijk), Genethon (Evry, Frankrijk) en Genopole (CERFE, Evry, Frankrijk). Wij danken Jo Ann Cahn voor haar zorgvuldige lezing van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door het Institut National de la Santé et de la Rechercher Médicale, Paris Descartes University, Pierre en Marie Curie Universiteit, de Association pour la Recherche contre le Cancer, de Tunesische Direction Générale de la Recherche Scientifique, de Frans-Tunesische CMCU project, en de acties Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) fondsen. JC werd gesteund door de Frontiers in Life Science Doctoral School en door een beurs van de INCA (Institut National du Cancer). RBA was een ontvanger van subsidies van de DGRS-INSERM en de CMCU. SD ontving een subsidie van het Institut National du Cancer.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |