生物発光イメージングは、腫瘍および転移をローカライズするためのよく知られたツールですが、これらの画像の定量化は、多くの場合、複雑な計算や特定の楽器を必要とします。我々には、計算を必要としない、正確な取得条件に基づいて、使いやすいluminoscore方法を説明し、マウスモデルで監視される腫瘍負荷および治療応答を可能にします。
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
初期の腫瘍細胞の検出は、課題のままであり、癌治療の有効性を高めるために重要である。 インビボでの生物発光イメージング(BLI)が広く小動物の腫瘍を監視するために使用される非常に敏感な、非侵襲的な光学技術です。ホタルルシフェラーゼを発現する細胞は、一般に、実験1,2のために使用されます。このオキシゲナーゼは、D-ルシフェリン分子状酸素で酸化するが、2つの補助因子を必要とする-のMg 2+およびアデノシン三リン酸3。その量子収率が高いので、ホタルルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ4よりもin vivoイメージングに適しています。
酸化された基質 – オキシルシフェリンは – 自然にその基本状態に戻す光子を放出した後、非アクティブになります。放出された光子は、530nmの付近で最大波長を持っています。高感度カメラは、小動物の内部からの発光の光子を検出し、POSSする画像を提供することができます腫瘍細胞を見つけるためにible。
光子カウントによって正確に腫瘍負荷を定量化する能力は、治療の有効性を定量化するための強力かつ敏感なツールとして役立つことができます。治療効果をより早く検出することができるので、この感度は、治療が有効となるに正確な瞬間を決定することを可能にするかもしれません。
総放出された光子の絶対定量化は非常に複雑です。収集された光子の数は、腫瘍の深さにし、光子が通って放出された臓器によって異なります。組織吸収係数に基づいて補正係数を5に計算することができるが、腫瘍細胞数の絶対的な定量化は、各腫瘍細胞によって放出された光子の数を知る必要があります。また、多くのレポーター遺伝子( 例えば 、蛍光タンパク質)のようなルシフェラーゼ発現は、単一のクローン6由来の細胞集団では、均質ではありません。ルシファーの数細胞内アーゼタンパク質は、正確に計算することができません。標準化された実験条件の確立は、このように信頼性の高い半定量分析のための重要な表示されます。
我々は2つの異なるマウスリンパ腫モデル7,8,9にluminoscore法を適用しました。これらのモデルでは、同系の腫瘍細胞は、眼内又はそれぞれ、プライマリ眼内リンパ腫(ポワル)モデルおよび皮下リンパ腫(SCL)モデルを得るために皮膚の下に注入されます。これらの同所性モデルのそれぞれにおいて、治療は、7日間ポワルために腫瘍接種後、in situで投与され、腫瘍は、SCLのためにその最大直径で0.5〜0.7センチメートルに達したとき。
我々は以前7,10,11有効であることが示され、 その場でのCpG療法での効果をモニターするためにluminoscore法を用いました。 CpGが順番に多数のCEにより発現する細胞内受容体であるオリゴヌクレオチド配列およびTLR9のリガンドであります樹状細胞、Bリンパ球、単球、およびナチュラルキラー細胞を含む免疫系のLLS、。 CpG-DNAは、CpG(CG)免疫刺激性モチーフを含む20マーのDNA配列です。コントロール(ODN-制御)免疫刺激CG配列は、(GC)が反転していることを除いて、同じ20マーのDNA配列です。私たちが研究しているマウスのリンパ腫におけるTLR9の関与は、アポトーシス10誘導する免疫系12を活性化し 、それによって大幅に腫瘍量7,11を軽減します。
ここでは、生物発光画像を介して、腫瘍の負担や治療反応を定量化するための標準化された方法を説明します。この方法は、信頼性、再現性、非ユーザ依存性、および統計的有意性を最適化するために、取得から解析まで、イメージング手順のさまざまな側面に依存しています。生物発光の定量指標は、各マウスに起因します。我々はluminoscoreを呼び出し、この値は、だけでなく、動物が、Alとを比較することができます実験間そう。
本研究では、生物発光イメージングの手順と同様にluminoscore法による画像定量化に焦点を当てます。我々は、注射を検証腫瘍負荷を監視し、 およびin situ癌治療での有効性を評価するためのこの方法の有効性を示します。これらの点の各々はluminoscore法の適応性を強調するために、異なるマウスモデルを用いた実験からの代表的な結果に示されています。
この制限は、任意の光学イメージングモダリティに固有のものであるが、臓器や組織による光の吸収は、生物発光イメージングの制限のまま。我々のアプローチの文脈では、luminoscoreの解剖学的構造の効果は研究がその後の比較を可能にする、与えられたモデル(位置及びマウス鎖)で行われることを条件とする低い変動性を有することが期待されます。生物発光は、励起光を必要としないので、より多くの蛍光よりも生体内撮像に全身に適合されます。
空間分解能はまた、生物発光イメージングの限界であり、生物発光の光子が放出される臓器の正確な位置は依然として困難です。しかし、モデルの十分な知識は、腫瘍部位の定性的な場所にすることができます。この生物発光ベースの方法で唯一の出力はluminoscoreです。場所はInteresの手動マークアップリージョンのでluminoscoreに影響を与えませんトン(ROI)は、マウス全体をカバーしています。最後に、ホタルルシフェラーゼは、酸素を必要とします。したがって、生物発光イメージングは、通常、壊死性腫瘍を過小評価します。もう一度、モデルのこの態様の十分な知識が必要です。
本稿では、(すでに7,9,11を実証されている)が、生物発光データセットの比較を可能にする方法を説明するために、抗腫瘍薬としてのCpGの有効性を評価することを目指していません。 我々は確かに異なる時間に異なる場所で異なるアッセイを比較するための取得プロトコルを標準化するためのもの腫瘍負荷を定量化する方法を説明し、それがコンピュータの計算を必要としません。再現性と正しい光子束の定量化を確実にするために、撮像装置は、自家製のデバイスのための光を参照してたり、商業デバイスのプロバイダによって推奨されるように較正されなければなりません。
私たちのプロトコルには、いくつかの重要なpまで細心の注意が必要ですointsは、(i)まず、マウスの麻酔の質が特に長い露光時間との例では、鮮明な画像を得るために重要です。 (ii)の定量化ユニットは、常に輝きは、各マウスの表面積に依存し、異なるマウスを比較するために無関係である可能性があるため、光子束でなければなりません。これらは、バイアスluminoscoreをだろうので、(iii)の生物発光画像は、飽和画素を含んではなりません。 (iv)のバックとフロント買収は、腫瘍部位( すなわち、フロント買収は必ずしも腫瘍の背面からの光子を検出しない場合があります)から放出された全ての光子を収集するために必要とされます。様々なROI図面はluminoscore法の開発中に試験されました。唯一の手動のマークアップ(データは示していない)、統計的に有意である可能性が高い満足のいく結果が得られました。
Inoueら。 75ミリグラムのルシフェリン線量をお勧めします/ 13 kgです。 150mgの用量を使用して/した後、代わりの撮像のタイミングをkgのルシフェリンの投与は変わらないと我々は高原が長時間露光買収を通じて持続することを確認してください。ルシフェリンは、取得プロセスを通して過剰反応体でなければなりません。私たちは、動物あたり2 ROIを描いたSCLモデルで示したように、モデルに応じて、関心領域は、適合させることができる。SCLモデルでは、治療は腫瘍が変動を制限するために、その最大直径が0.5cmに達したときに注入され、生着の。マウスによっては、腫瘍が異なって成長している可能性があります。マウスを標準と比較するために、我々は両脇腹の腫瘍の相対的な成長を明らかに扱われ、非処理側との間の比率を使用することにしました。
全く信号が正であることが期待注射したマウスから観察されていない場合、いずれかの(I)細胞の数が非常に低く、信号は検出限界以下です。または(ii)のマウスは、酸素を欠いており、即時の注意が必要です。
定量的bioluminescのいくつかレンスは、様々な著者によって記述分析放出された生物発光光子5,15の絶対定量に近づくように複雑な計算や楽器( 例えば 、3D生物発光トモグラフィー)が必要です。 2D生物発光イメージャー、特に腫瘍モデルでは、再現性生物発光を定量化するための方法については意見の一致はありません。私たちの目的は、ユーザー依存性を制限するために、画像取得プロトコルを標準化することでした。
腫瘍接種後のその場でのCpGの注入は、両方のモデルで腫瘍量を減少させました。 luminoscore方法は、腫瘍の免疫療法の他のモデルで腫瘍量をモニタリングするためのツールとして機能することができます。腫瘍負荷を監視することは、腫瘍の微小環境に干渉することなく、腫瘍の増殖と転移性のメカニズムの理解を向上させることができる非侵襲的方法を提供します。行うと、この方法での治療に応答しない動物の識別は、複数の検証によって補強されています実験の開始時uccessful腫瘍細胞の注射。
ここでA20.IIA-luc2細胞を用いたSCLモデルでluminoscore法の適応性を示しました。しかし、この方法は、それらが、ルシフェラーゼ、またはT細胞試験( その他の腫瘍特異的細胞傷害性T細胞、制御性T細胞)の文脈で発現することを提供される他の細胞株を使用して、他の腫瘍モデルに適合させることができます。稀な疾患の遺伝子治療の状況において、インビボでの遺伝子導入の監視もluminoscore法を用いて行うことができます。
最後に、データは、生物発光ベースluminoscore法は、実験間での比較を可能にする特定の実験のニーズに柔軟性と適応性を提供し、非侵襲的な長手方向の前臨床試験のための有用なツールであることを示しています。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、コルドリエ研究所(CEF、パリ、フランス)、Genethon(エヴリー、フランス) とGenopole(CERFE、エヴリー、フランス)の動物施設に感謝します。私たちは、原稿の彼女の慎重な読み取りのためにジョー・アン・カーンに感謝します。この研究は、研究所国立・デ・ラ・サンテエ・デ・ラ・RechercherMédicale、パリデカルト大学、ピエール&マリー・キュリー大学、協会ラRECHERCHE contreルがん、チュニジア方向ジェネラル・デ・ラ・RECHERCHE科学研究を注ぎ、仏チュニジアCMCUによってサポートされていましたプロジェクト、およびアクションThématiquesIncitativesデGenopole(ATIGE)資金。 JCは、ライフサイエンスの博士課程の学校フロンティアによっておよびINCA(研究所国立デュ癌)からの交わりによってサポートされていました。 RBAはDGRS-INSERMとCMCUからの助成金の受取人でした。 SDは、研究所国立デュ癌からの助成金を受けました。
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
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ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
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D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
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Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |