생물 발광 영상은 종양과 전이를 지역화 잘 알려진 도구이지만, 이러한 이미지의 정량화는 종종 복잡한 계산 및 특정 장비를 필요로한다. 우리는 더 계산을 요구하지 않으며, 종양 부담과 치료 반응이 마우스 모델에서 관찰 할 수 있도록 정확한 획득 상태에 기초하여, 사용하기 쉬운 luminoscore 방법을 설명한다.
Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.
초기 종양 세포 검출 도전 남아 암 치료 효능을 향상시키기위한 중요한 것이다. 생체 내 생물 발광 영상 (BLI)을 널리 작은 동물에서 종양을 모니터링하는 데 매우 중요한 비 침습적 광학 기술이다. 반딧불 루시 페라 제 발현 세포는 일반적으로 같은 실험 1, 2에 사용됩니다. 이 시게나 제는 D-루시페린 분자 산소와 산화하지만이 보조 인자를 필요로 – 마그네슘 2+ 및 아데노신 트리 포스페이트 3. 반딧불 루시 페라 제는 레 닐라 루시퍼 라제 (4)의 양자 수율이 높기 때문에보다 생체 내 이미징을위한 더 적합하다.
산화 된 기판 – oxyluciferin는 – 자연의 기본 상태로 돌아 광자를 방출하고 비활성화됩니다. 방출 된 광자는 530 nm의 주위에 최대 파장을 가지고있다. 고감도 카메라는 작은 동물의 내부에서 발광 된 광자를 검출하고 POSS 확인 화상을 제공 할 수있다종양 세포의 위치를 ible.
광자 계수에 의해 정확하게 종양 부담을 정량화 할 수있는 능력은 치료 효과를 정량화를위한 강력하고 중요한 도구 역할을 할 수있다. 치료 효과가 빨리 검출 될 수 있기 때문에,이 감도는 가능한 치료 효과가되는 정확한 순간을 결정하도록 할 수있다.
총 방출되는 광자의 절대 정량은 매우 복잡하다. 수집 된 광자의 수는 종양의 깊이 및 광자를 통해 출사되는 기관에 의존한다. 조직의 흡수 계수에 기초하여 보정 계수 5를 산출 할 수 있지만, 종양 세포 수의 절대 정량 각각의 종양 세포에 의해 방출되는 광자의 수를 알고 필요. 또한, 많은 리포터 유전자 (예., 형광 단백질)의 같은 루시 페라 제 표현, 심지어 단일 클론 (6)에서 파생 된 세포 집단에서 균일하지 않다. 루시퍼의 수세포 ASE 단백질은 정확하게 계산 될 수 없다. 표준화 된 실험 조건의 설립 따라서 신뢰할 수있는 반 정량 분석을위한 중요한 나타납니다.
우리는 두 개의 서로 다른 마우스 림프종 모델 7, 8, 9에 luminoscore 방법을 적용 하였다. 이 모델에서, 종양 세포 동계 눈에 대하여 각각, 주 인공 림프종 (안구 내) 모델 및 피하 림프종 (SCL) 모델을 얻기 피하 주입된다. 이러한 소성을 각 모델에서 치료 이레위한 안구 내 종양 접종 후, 반응계 내에서 투여되는 종양은 SCL에 대한 최대 직경이 0.5 내지 0.7 cm에 도달 할 때.
우리는 반응계의 CpG 치료의 효과를 모니터링하는 방법 luminoscore 사용 이전 7,10,11 효과적인 것으로 나타났다. 된 CpG 차례로 다수 CE 표현 세포 내 수용체 올리고 뉴클레오티드 서열 및 TLR9의 리간드수지상 세포, B 림프구, 단핵구, 자연 살해 세포를 포함한 면역계의 LLS. 의 CpG-DNA가 된 CpG (CG) 면역 모티브를 포함하는 20 메르의 DNA 서열이다; 제어부 (ODN 제어)는 면역 CG 서열 (GC) 반전되는 점을 제외하고는 같은 20 량체의 DNA 서열이다. 우리가 공부하는 쥐 림프종에 TLR9 참여는 세포 사멸 (10) 유도 면역 시스템 (12)을 활성화하여 크게 종양 부담 7,11을 줄일 수 있습니다.
여기에서 우리는 종양 부담과 생물 발광 영상을 통해 치료 반응을 정량화하기위한 표준화 된 방법을 설명합니다. 이 방법의 신뢰성, 재현성이 아닌 사용자 의존성 및 통계적 유의성을 최적화하기 위해, 획득에서 분석 촬상 과정의 다양한 측면에 의존한다. 생물 발광 정량 인덱스는 각 마우스에 기인한다; 우리는 luminoscore 호출이 값뿐만 아니라, 동물뿐만 알 사이에 비교 될 수있다실험 사이에 그렇게.
본 연구에서 우리는 생물 발광 이미징 절차뿐만 아니라 luminoscore 법에 의한 화상 정량화에 초점을 맞춘다. 우리는 사출 검증 종양 부담을 모니터링 및 시츄 암 치료에서의 효능을 평가하기위한 본 방법의 효과를 나타낸다. 이러한 점 각각은 luminoscore 방법의 적응성을 강조하기 위해 상이한 마우스 모델을 이용한 실험 결과로부터 대표적인 도시된다.
이 제한은 어떤 광학 이미징 양상에 고유 있지만 기관과 조직에 의한 광 흡수는 생물 발광 영상의 제한 남아있다. 우리의 접근 방식의 맥락에서, luminoscore의 해부학 적 구조의 효과를 연구 한 다음 비교를 허용하는 특정 모델 (위치 및 마우스 가닥)에서 수행되는 것을 제공 낮은 가변성을 가질 것으로 기대된다. 생물 발광이 여기 광이 필요하지 않기 때문에 형광보다 더 생체 이미징 전신하도록 구성된다.
공간 해상도는 생물 발광 영상의 한계, 그리고 생물 발광의 광자를 방출하는 기관의 정확한 위치는 어려운 남아있다. 그러나 모델의 좋은 지식은 종양 사이트의 질적 위치에 도움이 될 수 있습니다. 이 생물 발광 기반 방법의 유일한 출력은 luminoscore입니다. 위치는 luminoscore에 영향을주지 않는 가출의 수동 마크 업 지역 때문에t (ROI)은 전체 마우스를 다룹니다. 마지막으로, 반딧불 루시 페라 제는 산소를 필요로한다. 따라서, 생물 발광 영상은 일반적으로 괴사 성 종양을 과소 평가. 다시 한번, 모델의이 양태의 양호한 기술이 요구된다.
본 연구에서는 (7,9,11 이미 입증 된)하지만 생물 발광 데이터 세트의 비교를 가능하게하는 방법을 설명하기 위해 항암 약물 등의 CpG의 효능을 평가하는 것을 목표로하지 않는다. 우리는 참으로 다른 시간에 다른 장소에서 다른 분석을 비교 획득 프로토콜을 표준화하는 데 도움을주기위한 것 종양 부담을 정량화하는 방법을 설명하고 그 컴퓨터의 계산을 필요로하지 않습니다. 정확한 재현성 광자 플럭스 정량을 위해, 촬상 소자는 수제 장치 용 광 기준으로 교정하거나해야 상업용 장치 공급자가 권장.
우리의 프로토콜은 몇 가지 중요한 페이지에 세심한주의가 필요합니다oints (ⅰ) 우선, 마우스를 마취의 품질이 특히 긴 노출 시간을 갖는 경우에, 선명한 화상을 얻기 위해 중요하다. (ⅱ) 정량화 수단은 항상 래디언스 각 마우스의 표면 영역에 따라 서로 다른 마우스를 비교 무관 할 수 있으므로 광자 플럭스이어야한다. 이러한 바이어스 luminoscore을 때문에 (Ⅲ) 생물 발광 이미지는 포화 픽셀을 포함 할 수 없습니다. (ⅳ) 위로와 전면 인수는 종양 부위 (즉, 앞의 인수는 반드시 종양의 뒤쪽에서 광자를 검출 할 수 있음)에서 방출되는 모든 광자를 수집해야합니다. 다양한 다른 ROI 도면은 luminoscore 방법의 개발 과정에서 시험 하였다. 오직 수동 마크 업 (데이타 미기재) 유의 될 가능성이 만족스러운 결과를 얻었다.
이노우에 등. 75 밀리그램의 루시페린 도즈 추천 / 13 kg이다. 150 밀리그램의 투여 량을 사용하여 / 애프터 대신 촬상의 타이밍 kg의루시페린 관리는 변경되지 않습니다 그리고 우리는 고원 긴 노출 취득에 걸쳐 지속 있는지 확인합니다. 루시페린은 인수 과정 전반에 걸쳐 과잉 반응해야합니다. 우리는 동물 당 두 개의 ROI를 그린 SCL 모델 켰을 모델에 따라 관심 영역이 적응 될 수있다. SCL 모델에서 치료를 주입 종양 변동을 제한하는 그것의 최대 직경 0.5 cm에 도달 할 때 생착의. 마우스에 따라 종양 다르게 성장 있습니다. 표준화와 마우스를 비교하기 위해, 우리는 두 측면 종양의 상대적 성장을 보여 처리 및 비 처리 측 사이의 비율을 사용하기로 결정했다.
신호가 긍정적 인 것으로 예상 주입 된 마우스에서 관찰되지 않으면 (ⅰ)이 세포의 수가 매우 적고 신호가 검출 한계 미만이고; 또는 (ⅱ) 마우스는 산소가 부족하고 즉각적인 치료를 필요로한다.
양적 bioluminesc의 여러줬어 다양한 저자에 의해 기술 분석은 방출 생물 발광 광자 5,15의 절대 정량에 접근하는 복잡한 계산 및 기기 (예를 들면, 3D 생물 발광 단층 촬영)이 필요합니다. 2 차원 이미지 센서와 생물 발광, 특히 종양 모델에서 재현 생물 발광을 정량화하는 방법에 대한 합의가 없다. 우리의 목표는 사용자가 의존성을 제한하는 화상 획득 프로토콜을 표준화 하였다.
종양 접종 후 현장에서의 CpG의 주입은 두 모델에서 종양 부담을 감소시켰다. luminoscore 방법은 종양 면역의 다른 모델에서 종양 부담을 감시하는 도구로서 기능 할 수있다. 종양 부담을 모니터링 종양 미세 환경을 방해하지 않고 종양 성장을 전이 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수있는 비 침습적 방법을 제공한다. 수행 및이 방법으로 치료에 반응하지 않는 동물의 식별은의의 검증에 의해 강화된다실험의 시작시 uccessful 종양 세포 주입.
우리는 여기서 A20.IIA-luc2 셀을 사용하여 SCL 모델에서 luminoscore 방법의 적응성을 보였다. 그러나,이 방법은 다른 세포주들이 루시퍼 라제를 발현, 또는 설치하여 다른 종양 모델에 적응 될 수있는 T 세포 연구 (종양 특이 적 세포 독성 T 세포, 조절 T 세포 등)과 관련된다. 희귀 질환의 유전자 요법의 맥락에서 생체 내 유전자 전달의 모니터링도 luminoscore 방법을 사용하여 수행 될 수있다.
마지막으로 데이터는 생물 발광 기반 luminoscore 방법, 실험 사이의 비교를 가능하게 특정 실험 요구에 유연성과 적응성을 제공하며, 비 침습적 종 전임상 연구를위한 유용한 도구임을 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 프란체스코 회의 수도자 연구 센터 (CEF, 파리, 프랑스), Genethon (에브리, 프랑스)와 Genopole (CERFE, 에브리, 프랑스)의 동물 시설 감사합니다. 우리는 원고의 그녀의주의 읽기 조 앤 칸 (Cahn) 감사합니다. 이 연구는 연구소 국립 드 라 상테 엣 드 라 Rechercher MEDICALE, 파리 데카르트 대학, 피에르 & 마리 퀴리 대학, 협회 라 공들인 CONTRE 제작 : 암, 튀니지 방향 제너럴 드 라 공들인 과학원을 부어, 프랑스 – 튀니지 CMCU에 의해 지원되었다 프로젝트 및 Incitatives 드 Genopole (ATIGE) 자금 Thématiques 작업. JC는 생명 과학 박사 학교의 프론티어에 의해 그리고 INCA (연구소 국립 뒤 암)에서 화목에 의해 지원되었다. RBA는 DGRS – INSERM과 CMCU에서 보조금을받는 사람이었다. SD는 연구소 국립 뒤 암에서 교부금을 받았다.
CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
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ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
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D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
Ketamin | Virbac, France | ||
Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
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Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
Hamilton Precision Serynge 10µL | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
Eye ointment | Lacrinorm | ||
Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |