Микрокристаллизация кристаллов белков и<em> Разное</em> Дифракция
Summary
Протокол представлен для рентгеновской кристаллографии с использованием микрокристаллов белка. Сравниваются два примера, анализирующие in vivo- выращенные микрокристаллы после очистки или в целлюлозе .
Abstract
Появление высококачественных линий микрофокусировки на многих синхротронных объектах позволило провести обычный анализ кристаллов размером менее 10 мкм в их наибольшем измерении, который использовался для представления проблемы. Мы представляем два альтернативных рабочих процесса для определения структуры микрокристаллов белка с помощью рентгеновской кристаллографии с особым упором на кристаллы, выращенные in vivo . Микрокристаллы либо экстрагируют из клеток обработкой ультразвуком, либо очищают путем дифференциального центрифугирования, либо анализируют в целлюлозе после сортировки клеток с помощью проточной цитометрии кристаллосодержащих клеток. Необязательно, очищенные кристаллы или кристаллосодержащие клетки пропитываются в растворах тяжелых атомов для экспериментальной фазировки. Эти образцы затем подготавливают для дифракционных экспериментов аналогичным образом путем нанесения на подложку с микрометом и мгновенного охлаждения в жидком азоте. Кратко описываем и сравниваем серийные дифракционные эксперименты изолированных микрокристаллов и кристалло-Содержащих микрофокусную синхротронную лучевую линию для создания наборов данных, подходящих для фазирования, построения моделей и их доработки.
Эти рабочие процессы иллюстрируются кристаллами полиэдрина Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1), полученным путем заражения клеток насекомых рекомбинантным бакуловирусом. В этом случае исследование в целлюлозном анализе более эффективно, чем анализ очищенных кристаллов, и дает структуру через ~ 8 дней от экспрессии до измельчения.
Introduction
Использование рентгеновской кристаллографии для определения структур с высоким разрешением биологических макромолекул наблюдалось устойчивое прогрессирование в течение последних двух десятилетий. Растущее поглощение рентгеновской кристаллографии неспециалистскими исследователями иллюстрирует демократизацию этого подхода во многих областях наук о жизни 1 .
Исторически кристаллы с размерами менее ~ 10 мкм считались сложными, если не непригодными для определения структуры. Растущая доступность выделенных микрофокусных лучей для источников синхротронного излучения во всем мире и технологических достижений, таких как разработка инструментов для управления микрокристаллами, устранила большую часть этих барьеров, что затихло широким использованием рентгеновской микрокристаллической системы. Достижения в серийной рентгеновской микрокристаллографии 2 , 3 и дифракции микроэлектронов 4 гаПоказали, что использование микро- и нанокристаллов для определения структуры не только осуществимо, но и иногда предпочтительнее использования крупных кристаллов 5 , 6 , 7 .
Эти достижения были впервые применены к изучению пептидов 8 и природных кристаллов, продуцируемых вирусами насекомых 9 , 10 . Они теперь используются для широкого круга биологических макромолекул, включая самые сложные системы, такие как мембранные белки и большие комплексы 11 . Чтобы облегчить анализ этих микрокристаллов, они были проанализированы в мезо , в частности мембранных белках 12 и микрочипах микрожидкостей 13 .
Наличие этих новых методологий микрокристаллизации повысило возможность использования вVivo как новый путь для структурной биологии 14 , 15 , 16, предлагающий альтернативу классическому кристаллогенезу in vitro . К сожалению, даже когда кристаллы in vivo могут быть получены, остается несколько препятствий, таких как деградация или потеря лигандов во время очистки от клеток, трудности в манипулировании и визуализации кристаллов на синхротронной пучке и утомительные эксперименты по дифракции рентгеновских лучей. В качестве альтернативных кристаллов также анализировали непосредственно внутри клетки без какой-либо стадии очистки 17 , 18 , 19 . Сравнительный анализ показывает, что такие в подходах целлюлозы могут быть более эффективными, чем анализ очищенных кристаллов и получение данных с более высоким разрешением 20 .
Этот протокол находится вКак правило, помогали исследователям, новым для микрокристаллизации белка. Он предоставляет методологии, ориентированные на подготовку проб и манипулирование экспериментами рентгеновской дифракции на синхротронной пучке. Предлагаются два варианта использования изолированных кристаллов для классической микрокристаллической или кристаллически-содержащих клеток, отсортированных по проточной цитометрии для целлюлитного анализа ( рис. 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предусматривает два подхода к анализу микрокристаллов с целью облегчения анализа очень мелких кристаллов, которые в прошлом бы упускались из виду.
Критические этапы очистки микрокристаллов
Представленный протокол оптимизирован с использов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Chan-Sien Lay для предоставления снимков очищенных микрокристаллов, Даниэля Эрикссона и Тома Карадока-Дэвиса для поддержки на линии луча MX2 австралийского синхротрона, а также Кэтрин Фланаган и Эндрю Фриги из объекта FlowCore в Университете Монаш для их Неоценимую помощь.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).
