Summary

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em> Em Cellulo</em> Difração

Published: July 21, 2017
doi:

Summary

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Abstract

O advento de linhas de luz de microfoco de alta qualidade em muitas instalações de sincrotrona permitiu a análise de rotina de cristais menores que 10 μm em sua maior dimensão, o que representava um desafio. Apresentamos dois fluxos de trabalho alternativos para a determinação da estrutura de microcristais de proteínas por cristalografia de raios X com foco particular em cristais crescidos in vivo . Os microcristais são extraídos de células por sonicação e purificados por centrifugação diferencial, ou analisados em celulo após classificação celular por citometria de fluxo de células que contêm cristais. Opcionalmente, os cristais purificados ou as células que contêm cristais são embebidos em soluções de átomos pesados ​​para a fase experimental. Essas amostras são então preparadas para experiências de difracção de maneira similar por aplicação em um suporte micromesh e refrigeração instantânea em nitrogênio líquido. Nós descrevemos e comparamos brevemente experiências de difracção em série de microcristais isolados e cristal-Contendo células usando uma linha de luz de sincrotron microfocus para produzir conjuntos de dados adequados para faseamento, modelagem e refinamento.

Esses fluxos de trabalho são exemplificados com cristais do poliedro Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produzido por infecção de células de insetos com um baculovírus recombinante. Neste estudo de caso, a análise do cellulo é mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produz uma estrutura em ~ 8 dias da expressão ao refinamento.

Introduction

O uso de cristalografia de raios-X para a determinação de estruturas de alta resolução de macromoléculas biológicas experimentou uma progressão constante ao longo das duas últimas décadas. A crescente aceitação da cristalografia de raios-X por pesquisadores não especializados exemplifica a democratização desta abordagem em muitos campos das ciências da vida 1 .

Historicamente, os cristais com dimensões abaixo de ~ 10 μm foram considerados desafiadores, se não inutilizáveis, para a determinação da estrutura. A crescente disponibilidade de linhas de feixe de microfoco dedicadas em fontes de radiação sincrotrona em todo o mundo e os avanços tecnológicos, como o desenvolvimento de ferramentas para manipular microcristas, eliminaram grande parte dessas barreiras que bloquearam o amplo uso da microcristalografia de raios-X. Avanços em microcristalografia serial em raios-X 2 , 3 e difração micro-eletrônica 4 haMostramos que o uso de micro e nanocristais para a determinação da estrutura não é apenas viável, mas também às vezes preferível ao uso de cristais grandes 5 , 6 , 7 .

Estes avanços foram primeiro aplicados ao estudo de péptidos 8 e cristais naturais produzidos por vírus de insetos 9 , 10 . Eles são agora utilizados para uma variedade diversificada de macromoléculas biológicas, incluindo os sistemas mais difíceis, como proteínas de membrana e grandes complexos 11 . Para facilitar a análise desses microcristais, eles foram analisados em meso , particularmente proteínas de membrana 12 e em chips de microfluídica 13 .

A disponibilidade dessas novas metodologias de microcristalografia aumentou a possibilidade de usar emCristalização in vivo como uma nova rota para biologia estrutural 14 , 15 , 16 oferecendo uma alternativa à cristalogênese clássica in vitro . Infelizmente, mesmo quando os cristais in vivo podem ser produzidos, vários obstáculos permanecem como a degradação ou perda de ligandos durante a purificação das células, a dificuldade na manipulação e visualização dos cristais na linha do sincrotrão e as tediosas experiências de difracção de raios X. Como os cristais alternativos também foram analisados ​​diretamente dentro da célula sem qualquer passo de purificação 17 , 18 , 19 . Uma análise comparativa sugere que tal em abordagens de celulo pode ser mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produzir dados de maior resolução 20 .

Este protocolo está emTendeu a auxiliar pesquisadores novos na microcristalografia protéica. Ele fornece metodologias com foco na preparação e manipulação de amostras para experiências de difracção de raios X em uma linha de luz de sincrotrona. Duas opções são propostas usando cristais isolados para microcristalografia clássica ou células contendo cristais classificadas por citometria de fluxo para análise celular ( Figura 1 ).

Protocol

Nota: a cristalização in vivo tem sido relatada em muitos organismos, incluindo bactérias, leveduras, plantas, insetos e mamíferos (revisado na referência 21 ). A cristalização de proteínas recombinantes também foi conseguida no laboratório usando transfecção transitória de células de mamíferos e infecção por baculovírus de células de insetos. O protocolo a seguir foi desenvolvido utilizando o gene de poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clonad…

Representative Results

Uma visão geral de ambos os métodos alternativos para a determinação da estrutura utilizando microcristais in vivo é apresentada ( Figura 1 ). Os poliedros podem ser facilmente purificados por sonicação e centrifugação. Devido à sua densidade, eles formam uma camada na parte inferior do tubo por baixo de uma camada de detritos que podem ser removidos por pipetagem ( Figura 3a e 3b ). A amostra…

Discussion

Este protocolo fornece duas abordagens para analisar os microcristais com o objetivo de facilitar a análise de cristais muito pequenos que teriam sido ignorados no passado.

Passos críticos para a purificação de microcristal
O protocolo apresentado foi otimizado usando o poliedrino Bombyx mori CPV1 expresso em células Sf9 como um modelo de sistema. No entanto, os microcristais in vivo apresentam uma grande variabilidade na resistência mecânica….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de reconhecer Chan-Sien Lay por fornecer imagens de microcristais purificados, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies para obter suporte na linha de transmissão MX2 do Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga da unidade FlowCore na Universidade Monash para os seus Assistência inestimável.

Materials

Sf9 cells Life Technologies
SF900-SFM insect medium Life Technologies
1L cell culture flask Thermofisher Scientific
Shaking incubator for insect cell culture Eppendorf
50mL conical tubes Falcon
Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes Eppendorf
Sonicator equiped with a 19mm probe MSE Soniprep 150 
Glass slides Hampton Research
Hemacytometer Sigma-Aldrich
Propidium iodide Thermofisher Scientific
BD Influx cell sorter  BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens Hampton Research
Microcentrifuge Eppendorf
Micromesh Mitigen 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.
Paper wick Mitigen The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.
Ethylene glycol Sigma-Aldrich
Trypan blue Life Technologies
MX2 microfocus beamline Australian Synchrotron A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography.
Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806,
doi:10.1071/CH14455.

References

  1. Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
  2. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
  3. Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
  4. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
  5. Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
  6. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
  7. Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
  8. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
  9. Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
  10. Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
  11. Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
  12. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
  13. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
  14. Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
  15. Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
  16. Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
  17. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
  18. Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
  19. Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
  20. Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
  21. Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
  22. Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
  23. Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
  24. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
  25. Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
  26. Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
  27. Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
  28. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
  29. Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
  30. Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
  31. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
  32. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
  34. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
  36. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  37. Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
  38. Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
  39. Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
  40. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
  41. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
  42. Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
  43. Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).

Play Video

Cite This Article
Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction. J. Vis. Exp. (125), e55793, doi:10.3791/55793 (2017).

View Video