Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em> Selülozda</emKırınım
Summary
Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.
Abstract
Birçok sinkrotron tesisindeki yüksek kaliteli mikro odaklı ışın çizgilerinin ortaya çıkması, bir meydan okumayı temsil etmek için kullanılan en büyük boyutunda 10 μm'den küçük kristallerin rutin analizine izin vermiştir. X-ışını kristalografisi ile protein mikrokristallerinin yapısı tespiti için in vivo olarak yetiştirilen kristaller üzerine odaklanılarak iki alternatif iş akışını sunuyoruz. Mikrokristaller sonikasyon ile hücrelerden ekstrakte edilir ve diferansiyel santrifüj ile saflaştırılır veya kristal içeren hücrelerin akış sitometrisi ile hücre tasnif edilmesinden sonra selülozda analiz edilir. İsteğe bağlı olarak, saflaştırılmış kristaller veya kristal içeren hücreler, deney aşamasında ağır atom çözeltilerine batırılır. Bu örnekler, mikrometre bir desteğe uygulama ve sıvı azotta flaş soğutması ile benzer şekilde difraksiyon deneyleri için hazırlanır. İzole edilmiş mikro kristallerin ve kristalin kırınım deneylerinin kısaca tanımlanması ve karşılaştırılmasıModel oluşturma ve iyileştirme için uygun veri kümeleri üretmek için bir mikrofocus sinkrotron beamline kullanan hücreler içerir.
Bu iş akışları, böcek hücrelerinin bir rekombinant bakülovirüs ile enfekte edilmesiyle üretilen Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polidrin kristalleriyle örneklendirilir. Bu vaka çalışmasında, selülo analizinde saflaştırılmış kristallerin analizinden daha verimlidir ve ekspresyondan arıtmaya kadar ~ 8 gün içinde bir yapı meydana getirir.
Introduction
Biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarının belirlenmesinde X-ışını kristalografisinin kullanımı, son yirmi yılda sürekli bir ilerleme kaydetti. Uzman olmayan araştırmacılar tarafından X-ışını kristalografisinin artan alımı, bu yaklaşımın birçok alanda 1 hayat bilimleri alanında demokratikleşmesini örneklendirmektedir 1 .
Tarihsel olarak, ~ 10 μm altında boyutlardaki kristaller, yapı tespiti için kullanışlı olmasa da, zorlayıcı olarak kabul edilmiştir. Dünyadaki senkrotron ışın kaynakları ve mikro kristalleri idare eden aletlerin geliştirilmesi gibi teknolojik gelişmeler sayesinde özel mikro odaklı kirişlerin artan miktarda bulunması, X-ışını mikro-kristalografisinin geniş kullanımını engelleyen bu engellerin çoğunu ortadan kaldırdı. Seri X-ışını mikrokristalografisinde gelişmeler 2 , 3 ve mikro elektron kırınımı 4 haYapı tayini için mikro ve nanokristallerin kullanımının sadece mümkün olmadığı değil aynı zamanda bazen büyük kristaller 5 , 6 , 7'nin kullanılmasına tercih edildiğini göstermiştir.
Bu ilerlemeler ilk olarak peptitler 8 ve böcek virüsleri 9 , 10 tarafından üretilen doğal kristaller üzerine uygulanmıştır. Bunlar artık membran proteinleri ve büyük kompleksler gibi en zorlu sistemleri içeren biyolojik makromoleküllerin çeşitliliği için kullanılmaktadır 11 . Bu mikro kristallerin analizini kolaylaştırmak için meso , özellikle de membran proteinleri 12 ve mikroakışkan yongalar 13 içinde analiz edilmiştir.
Bu yeni mikro-kristalografi yöntemlerinin varlığı ,In vitro kristalojeneze klasik bir alternatif sunan yapısal biyoloji 14 , 15 , 16 için yeni bir yol olarak in vivo kristalizasyon. Ne yazık ki, in vivo kristaller üretilse bile, hücrelerden arındırma sırasında ligandların bozulması veya kaybı, senkrotron beamline'daki kristallerin manipülasyonu ve görüntülenmesindeki zorluklar ve sıkıcı X-ışını kırınım deneyleri gibi birçok engel kalmaktadır. Alternatif bir kristaller, herhangi bir saflaştırma adımı olmadan doğrudan hücre içinde analiz edilmiştir 17 , 18 , 19 . Karşılaştırmalı bir analizi cellulo yaklaşımlarında, saflaştırılmış kristallerin ve daha yüksek çözünürlük 20 verim verileri analizi daha etkili olabileceğini göstermektedir.
Bu protokolProtein mikrokristalografisinde yeni araştırmacılara yardımcı olma eğilimindeydi. Bir sinkrotron beamline'da X-ışını kırınımı deneyleri için örnek hazırlama ve manipülasyon üzerine odaklanan metodolojileri sağlar. Selüloz analizinde akış sitometrisi ile klasik mikrokristalografide veya kristal içeren hücreler için izole edilmiş kristaller kullanılarak iki seçenek önerilmiştir ( Şekil 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, geçmişte göz ardı edilen çok küçük kristallerin analizini kolaylaştırmak amacıyla mikro kristalleri analiz etmek için iki yaklaşım sunmaktadır.
Mikrokristal arıtım için kritik adımlar
Sunulan protokol, bir model sistem olarak Sf9 hücrelerinde eksprese edilen Bombyx mori CPV1 polihedrini kullanarak optimize edilmiştir. Bununla birlikte, in vivo mikro kristaller mekanik direnç açısından büyük bir değişkenliğe …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Avustralya Synchrotron'un MX2 beamline'ında destek için saflaştırılmış mikro kristaller, Daniel Eriksson ve Tom Caradoc-Davies, ve Monash Üniversitesi'ndeki FlowCore tesisindeki Kathryn Flanagan ve Andrew Fryga'nın resimlerinin sağlanması için Chan-Sien Lay'i onaylamak istiyorlar. Paha biçilmez yardım.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).
