Microcristalografía de Protein Crystals y<em> En Cellulo</em> Difracción
Summary
Se presenta un protocolo para la cristalografía de rayos X utilizando microcristales de proteínas. Se comparan dos ejemplos que analizan microcristales de crecimiento in vivo después de la purificación o en celulo .
Abstract
El advenimiento de líneas de luz de microfoco de alta calidad en muchas instalaciones de sincrotrón ha permitido el análisis de rutina de cristales menores de 10 μm en su dimensión más grande, lo que representaba un desafío. Presentamos dos flujos de trabajo alternativos para la determinación de la estructura de microcristales de proteínas por cristalografía de rayos X con un enfoque particular en los cristales crecidos in vivo . Los microcristales se extraen de las células mediante sonicación y se purifican mediante centrifugación diferencial o se analizan en celulo después de la clasificación celular mediante citometría de flujo de células que contienen cristal. Opcionalmente, los cristales purificados o las células que contienen cristal se empapan en soluciones de átomos pesados para el phasing experimental. Estas muestras se preparan entonces para experimentos de difracción de una manera similar por aplicación sobre un soporte de micromesh y enfriamiento rápido en nitrógeno líquido. Describimos brevemente y comparar los experimentos de difracción en serie de microcristales aislados y cristal-Que contienen células que utilizan una línea de luz de sincrotrón microfoco para producir conjuntos de datos adecuados para la fase, la construcción de modelos y el refinamiento.
Estos flujos de trabajo se ejemplifican con cristales de la poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) producida por la infección de células de insecto con un baculovirus recombinante. En este caso de estudio, en el análisis de celulo es más eficiente que el análisis de cristales purificados y produce una estructura en ~ 8 días desde la expresión hasta el refinamiento.
Introduction
El uso de la cristalografía de rayos X para la determinación de estructuras de alta resolución de macromoléculas biológicas ha experimentado una progresión constante en las últimas dos décadas. La creciente aceptación de la cristalografía de rayos X por investigadores no expertos ejemplifica la democratización de este enfoque en muchos campos de las ciencias de la vida 1 .
Históricamente, los cristales con dimensiones inferiores a ~ 10 μm han sido considerados como desafiantes, si no inutilizables, para la determinación de la estructura. La creciente disponibilidad de rayos de luz de microfoco dedicados a fuentes de radiación de sincrotrón en todo el mundo y los avances tecnológicos, tales como el desarrollo de herramientas para manipular microcristales, han eliminado gran parte de estas barreras que obstaculizan el amplio uso de la microcristalografía de rayos X. Avances en microcristalografía de rayos X serie 2 , 3 y micro difracción de electrones 4 haHemos demostrado que el uso de micro y nanocristales para la determinación de la estructura no sólo es factible, sino que a veces es preferible al uso de grandes cristales 5 , 6 , 7 .
Estos avances se aplicaron por primera vez al estudio de péptidos [ 8] y cristales naturales producidos por virus de insectos [ 9 , 10] . Ahora se utilizan para una amplia gama de macromoléculas biológicas, incluyendo los sistemas más difíciles, como proteínas de membrana y grandes complejos [ 11] . Para facilitar el análisis de estos microcristales, se han analizado en meso , en particular proteínas de membrana 12 y en chips microfluídicos 13 .
La disponibilidad de estas nuevas metodologías microcrystallography ha planteado la posibilidad de utilizar enComo una nueva ruta para la biología estructural 14 , 15 , 16 que ofrece una alternativa a la cristalogénesis clásica in vitro . Desafortunadamente, incluso cuando se pueden producir cristales in vivo , quedan varios obstáculos tales como la degradación o pérdida de ligandos durante la purificación de las células, dificultad en la manipulación y visualización de los cristales en la línea de luz del sincrotrón y tediosos experimentos de difracción de rayos X. Como una alternativa cristales también se han analizado directamente dentro de la célula sin ningún paso de purificación 17 , 18 , 19 . Un análisis comparativo sugiere que tal en los enfoques cellulo puede ser más eficiente que el análisis de cristales purificados y los datos de rendimiento de mayor resolución [ 20] .
Este protocolo está enTendieron a ayudar a los investigadores nuevos a la microcristalografía de proteínas. Proporciona metodologías centradas en la preparación y manipulación de muestras para experimentos de difracción de rayos X en una línea de luz de sincrotrón. Se proponen dos opciones utilizando cristales aislados para microcristalografía clásica o células que contienen cristal ordenadas por citometría de flujo para análisis de celulo ( Figura 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona dos enfoques para analizar microcristales con el objetivo de facilitar el análisis de cristales muy pequeños que se hubieran pasado por alto en el pasado.
Pasos críticos para la purificación de microcristales
El protocolo presentado ha sido optimizado utilizando la poliedrina Bombyx mori CPV1 expresada en células Sf9 como sistema modelo. Sin embargo, los microcristales in vivo muestran una gran variabilidad en la resis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer a Chan-Sien Lay por proporcionar fotografías de microcristales purificados, Daniel Eriksson y Tom Caradoc-Davies para apoyo en la línea de rayos MX2 del sincrotrón australiano y Kathryn Flanagan y Andrew Fryga de la instalación FlowCore de la Universidad Monash por su Ayuda invaluable.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).
