Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em> בסולו</em> השתברות
Summary
פרוטוקול מוצג עבור קריסטלוגרפיה רנטגן באמצעות microcrystals חלבון. שתי דוגמאות ניתוח vivo- microcrystals מגודלים לאחר טיהור או תאמול מושווים.
Abstract
הופעת של beamlines microfocus באיכות גבוהה במתקנים סינכרוטרון רבים אפשרה ניתוח שגרתית של גבישים קטנים מ 10 מיקרומטר במימד הגדול ביותר שלהם, אשר שימשו אתגר. אנו מציגים שני workflows חלופי עבור קביעת המבנה של microcrystals חלבונים על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן עם דגש מיוחד על גבישים הגדלים in vivo . Microcrystals הם גם מחלץ תאים על ידי sonication ו מטוהרים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלי, או ניתח ב תאית לאחר מיון התא על ידי cytometry הזרימה של תאים המכילים קריסטל. לחלופין, גבישים מטוהרים או תאים המכילים קריסטל נספגים בפתרונות אטום כבדים לניקוי ניסיוני. דגימות אלה מוכנים אז ניסויים עקיפה באופן דומה על ידי יישום על תמיכה מיקרומטר פלאש קירור חנקן נוזלי. אנו מתארים בקצרה ולהשוות ניסויים עקיפה טורית של microcrystals מבודדים,המכילים תאים באמצעות microfocus beamline synfrotron לייצר מערכי מתאים fasing, בניית מודל ועידון.
זרימות עבודה אלה מודגמות עם גבישים של פוליפרום מורי cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin המיוצר על ידי זיהום של תאים חרקים עם baculovirus רקומביננטי. במחקר זה, בניתוח תאית הוא יעיל יותר מאשר ניתוח של גבישים מטוהרים התשואות מבנה ~ 8 ימים מן הביטוי כדי חידוד.
Introduction
השימוש של קריסטלוגרפיה רנטגן לקביעת מבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות ביולוגיות חווה התקדמות מתמדת בשני העשורים האחרונים. הגדילה הגוברת של קריסטלוגרפיה רנטגן על ידי חוקרים שאינם מומחים מדגים את הדמוקרטיזציה של גישה זו בתחומים רבים של מדעי החיים 1 .
מבחינה היסטורית, גבישים עם מימדים מתחת ~ 10 מיקרומטר נחשבו מאתגרים, אם לא בלתי שמישים, עבור קביעת מבנה. הזמינות הגוברת של מיקרופוקוס ייעודי מקורות beamlinesat synchrotron קרינה ברחבי העולם והתקדמות טכנולוגית, כגון פיתוח של כלים לתפעל microcrystals, יש להסיר הרבה מחסומים אלה כי stymied השימוש הרחב של microcrystallography רנטגן. ההתקדמות מיקרוסקריאלוגרפיה טורית של רנטגן 2 , 3 ו מיקרו אלקטרונים עקיפה 4 חההראו כי השימוש מיקרו ו nanocrystals עבור קביעת המבנה הוא לא רק ריאלי אלא גם לפעמים עדיף על השימוש גבישים גדולים 5 , 6 , 7 .
התקדמויות אלה יושמו לראשונה על המחקר של פפטידים 8 גבישים טבעיים המיוצרים על ידי וירוסים חרקים 9 , 10 . הם משמשים כיום למגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות, כולל המערכות הקשות ביותר, כגון חלבונים בממברנה ומתחמים גדולים 11 . כדי להקל על ניתוח של microcrystals אלה, הם נותחו ב meso , במיוחד חלבונים ממברנה 12 ו שבבי microfluidics 13 .
הזמינות של מתודולוגיות מיקרו-קריסטלוגרפיות חדשות אלה העלתה את האפשרות להשתמש בVivo התגבשות כמו תוואי חדש עבור ביולוגיה מבנית 14 , 15 , 16 מציע חלופה קלאסית במבחנה חוץ גופית . למרבה הצער, גם כאשר קריסטלים vivo יכול להיות מיוצר, מספר מכשולים להישאר כגון השפלה או אובדן ligands במהלך הטיהור מן התאים, קושי במניפולציה ו להדמיה של גבישים על beamline synchrotron ו מייגעת רנטגן ניסויים רנטגן. כמו גבישים חלופיים יש גם ניתחו ישירות בתוך התא ללא כל שלב טיהור 17 , 18 , 19 . ניתוח השוואתי מצביע על כך כי גישות תאית יכול להיות יעיל יותר מאשר ניתוח של גבישים מטוהרים נתוני התשואה של ברזולוציה גבוהה יותר 20 .
פרוטוקול זה הוא בנוטה לסייע לחוקרים חדשים microcrystallography חלבון. הוא מספק מתודולוגיות התמקדות הכנה המדגם מניפולציה עבור רנטגן עקיפה ניסויים beamline synchrotron. שתי אפשרויות מוצעות באמצעות גבישים מבודדים microcrystallography קלאסי או תאים המכילים גביש מיון לפי cytometry זרימה לניתוח cellulo ( איור 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק שתי גישות לנתח microcrystals במטרה להקל על ניתוח של גבישים קטנים מאוד, כי היה להתעלם בעבר.
צעדים קריטיים לטיהור microcrystal
הפרוטוקול המוצג כבר אופטימיזציה באמצעות Bombyx מורי CPV1 polyhedrin לידי ביטוי בתאים Sf9 כמע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים היו רוצים להודות Chan-Sien Lay על מתן תמונות של microcrystals מטוהרים, דניאל אריקסון וטום Caradoc-Davies לתמיכה בקו mx2 של סינכרוטרון האוסטרלי, ו קתרין פלנגן ואנדרו פריגה ממכון FlowCore באוניברסיטת מונאש עבור שלהם לא יסולא בפז.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).
