Microkristallografie van eiwitkristallen en<em> In Cellulo</em> Diffractie
Summary
Een protocol wordt gepresenteerd voor röntgenkristallografie onder toepassing van eiwitmicrokristallen. Twee voorbeelden die in vivo- gegroeide microkristallen analyseren na zuivering of in cellulose worden vergeleken.
Abstract
De komst van microfocus van hoge kwaliteit bij veel synchrotronfaciliteiten heeft de routineanalyse van kristallen kleiner dan 10 μm in hun grootste dimensie toegestaan, die een uitdaging vertegenwoordigde. We presenteren twee alternatieve workflows voor de structuurbepaling van eiwitmicrokristallen door röntgenkristallografie met een speciale focus op in vivo gekweekte kristallen. De microkristallen worden ofwel geëxtraheerd uit cellen door sonicatie en gezuiverd door differentiële centrifugatie, of geanalyseerd in cellulose na celsortering door stromingscytometrie van kristalbevattende cellen. Eventueel worden gezuiverde kristallen of kristalbevattende cellen geweekt in zware atoomoplossingen voor experimentele fase. Deze monsters worden vervolgens op diffra- tieve experimenten op soortgelijke wijze bereid door toepassing op een micromesh-ondersteuning en flashkoeling in vloeibare stikstof. We beschrijven en vergelijken serie-diffractie-experimenten van geïsoleerde microkristallen en kristal-Bevattende cellen met behulp van een microfocus synchrotron beamline om datasets te produceren die geschikt zijn voor fasering, modelbouw en verfijning.
Deze werkstromen worden geïllustreerd met kristallen van het Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrine geproduceerd door infectie van insectencellen met een recombinant baculovirus. In deze casestudy is celluloanalyse efficiënter dan analyse van gezuiverde kristallen en levert een structuur in ~ 8 dagen van expressie tot verfijning.
Introduction
Het gebruik van röntgenkristallografie voor de bepaling van hoge resolutie structuren van biologische macromoleculen heeft de afgelopen twee decennia een constante progressie beleefd. De groeiende opname van röntgenkristallografie door niet-deskundige onderzoekers illustreert de democratisering van deze benadering op vele gebieden van de levenswetenschappen 1 .
Historisch gezien zijn kristallen met afmetingen onder ~ 10 μm beschouwd als uitdagend, indien niet onbruikbaar, voor structuurbepaling. De toenemende beschikbaarheid van toegewijde microfocus bundellijnen voor synchrotron stralingsbronnen wereldwijd en technologische vooruitgang, zoals de ontwikkeling van gereedschappen om microkristallen te manipuleren, hebben veel van deze barrières verwijderd die het brede gebruik van röntgen microkristallografie hebben verbannen. Vooruitgang in seriële röntgen microkristallografie 2 , 3 en micro elektronen diffractie 4 haHet is gebleken dat het gebruik van micro- en nanokristallen voor het bepalen van de structuur niet alleen haalbaar is, maar ook soms voor het gebruik van grote kristallen 5 , 6 , 7 .
Deze vooruitgang werd eerst toegepast op de studie van peptiden 8 en natuurlijke kristallen geproduceerd door insectenvirussen 9 , 10 . Ze worden nu gebruikt voor een breed scala van biologische macromoleculen, waaronder de moeilijkste systemen zoals membraanproteïnen en grote complexen 11 . Om de analyse van deze microkristallen te vergemakkelijken, zijn ze geanalyseerd in meso , in het bijzonder membraaneiwitten 12 en in microfluidica chips 13 .
De beschikbaarheid van deze nieuwe microkristallografie methodologieën heeft de mogelijkheid geboden om in te gebruikenVivo kristallisatie als een nieuwe route voor structurele biologie 14 , 15 , 16 die een alternatief biedt voor klassieke in vitro kristallogenese. Helaas, zelfs wanneer in vivo kristallen kunnen worden geproduceerd, blijven verschillende obstakels zoals de afbraak of verlies van liganden tijdens de zuivering van cellen, moeilijkheid bij manipulatie en visualisatie van de kristallen bij de synchrotronbundel en vervelende röntgendiffractie-experimenten. Als alternatieve kristallen zijn ook direct in de cel geanalyseerd zonder enige zuiveringstap 17 , 18 , 19 . Een vergelijkende analyse suggereert dat dergelijke in cellulo- benaderingen efficiënter kunnen zijn dan de analyse van gezuiverde kristallen en levert data van hogere resolutie 20 op .
Dit protocol is inGeneigd om onderzoekers nieuw te helpen bij microcrystallografie van eiwitten. Het biedt methodologieën die zich richten op steekproefbereiding en manipulatie voor röntgendiffractie-experimenten op een synchrotronbundel. Twee opties worden voorgesteld met behulp van geïsoleerde kristallen voor klassieke microkristallografie of kristalbevattende cellen gesorteerd door flowcytometrie voor celluloanalyse ( Figuur 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol bevat twee benaderingen om microkristallen te analyseren met als doel het analyseren van zeer kleine kristallen die in het verleden zouden zijn over het hoofd gezien.
Kritieke stappen voor microkristalzuivering
Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd met behulp van Bombyx mori CPV1 polyhedrine uitgedrukt in Sf9-cellen als model systeem. In vivo microkristallen tonen echter een grote variabiliteit in mechanische weerstand. Bijvoorb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Chan-Sien Lay erkennen voor het leveren van foto's van gezuiverde microkristallen, Daniel Eriksson en Tom Caradoc-Davies voor ondersteuning bij de MX2-straal van de Australische Synchrotron, en Kathryn Flanagan en Andrew Fryga van de FlowCore-faciliteit van Monash University voor hun Onschatbare hulp.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).
