Bağırsak mukozal bağışıklık tepkilerini analiz etmek için immünokompetan çip üzerinde bağırsak modeli
Özet
Ayrıntılı protokolümüz, insan bağırsak mukozasını 3D yapılar ve çeşitli hücre tipleri ile simüle eden, mikrobiyal kolonizasyona yanıt olarak bağışıklık tepkilerinin ve hücresel fonksiyonların derinlemesine analizini sağlayan gelişmiş çip üzerinde bağırsak modelinin oluşturulmasını ve kullanımını özetlemektedir.
Abstract
Epitelyal 3D organotipik, villus benzeri ve kript benzeri yapıları yeniden oluşturan gelişmiş bir çip üzerinde bağırsak modeli geliştirilmiştir. İmmünkompetan model, İnsan Göbek Veni Endotel Hücreleri (HUVEC), Caco-2 bağırsak epitel hücreleri, dokuda yerleşik makrofajlar ve doku içinde kendi kendini organize eden, insan bağırsak mukozasının özelliklerini yansıtan dendritik hücreleri içerir. Bu platformun benzersiz bir yönü, dolaşımdaki insan birincil bağışıklık hücrelerini entegre etme ve fizyolojik alaka düzeyini artırma kapasitesidir. Model, bağırsak bağışıklık sisteminin bakteri ve mantar kolonizasyonu ve enfeksiyonuna tepkisini araştırmak için tasarlanmıştır. Genişletilmiş boşluk boyutu nedeniyle model, geçirgenlik deneyleri, sitokin salınımı ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu gibi çeşitli fonksiyonel okumalar sunar ve epitel hücre tabakası tarafından oluşturulan 3D yapıların immünofloresan ölçümü ile uyumludur. Bu vesileyle, hücre farklılaşması ve işlevi hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Çip üzerinde bağırsak platformu, mikrofizyolojik perfüze edilmiş bir biyoçip platformu içinde canlı bir mikrobiyotanın vekilleri ile insan konak dokusu arasındaki karmaşık etkileşimleri aydınlatmadaki potansiyelini göstermiştir.
Introduction
Çip Üzerinde Organ (OoC) sistemleri, geleneksel 2B hücre kültürü ile hayvan modelleri arasındaki boşluğu doldurabilen, gelişmekte olan bir 3B hücre kültürü tekniğini temsil eder. OoC platformları tipik olarak, zarlar veya hidrojeller gibi çok çeşitli iskeleler üzerinde büyütülen dokuya özgü hücreleri içeren bir veya daha fazla bölmeden oluşur1. Modeller, bir veya daha fazla tanımlanmış organotipik fonksiyonu taklit etme yeteneğine sahiptir. Pompalar, hücresel atık ürünlerin uzaklaştırılması, gelişmiş hücresel farklılaşma için beslenme ve büyüme faktörleri sağlanması ve temel in vivo koşulların yeniden oluşturulması için hücre kültürü ortamının sürekli mikroakışkan perfüzyonunu sağlar. Bağışıklık hücrelerinin entegrasyonu ile OoC sistemleri, in vitro 2’de insan bağışıklık tepkisini taklit edebilir. Bugüne kadar çok çeşitli organlar ve fonksiyonel birimler sunulmuştur1. Bu sistemler, ilaç testi 5,7 ve enfeksiyon çalışmaları6,8 için kolaylaştırılabilen vaskülatür 3, akciğer4, karaciğer 2,5 ve bağırsak6 modellerini içerir.
Burada, endotel astarı ve dokuda yerleşik makrofajlarla birleştirilmiş villus benzeri ve kript benzeri yapıların organotipik bir 3D topografyasını oluşturan insan epitel hücrelerini entegre eden bir çip üzerinde insan bağırsağı modeli sunuyoruz. Model, mikroskobik bir slayt formatında mikroakışkan olarak perfüze edilmiş bir biyoçip içinde kültürlenir. Her biyoçip iki ayrı mikroakışkan boşluktan oluşur. Her boşluk, gözenekli bir polietilen tereftalat (PET) zarı ile bir üst ve alt odaya bölünür. Zarın kendisi aynı zamanda hücrelerin her iki tarafta büyümesi için iskele görevi görür. Zarın gözenekleri, hücre katmanları arasında hücresel karışmayı ve hücre göçünü mümkün kılar. Her odaya iki dişi luer kilit boyutunda bağlantı noktası ile erişilebilir. İsteğe bağlı olarak, ek bir mini-luer kilit boyutlu bağlantı noktası, üst veya alt bölmeye erişim sağlayabilir (Şekil 1).
OoC platformu, tek bir deneyden elde edilebilecek bir dizi okuma sunar. Çip üzerinde bağırsak, hücre işaretleyici ekspresyonu, metabolizasyon oranları, bağışıklık tepkisi, mikrobiyal kolonizasyon ve enfeksiyonve bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için perfüze edilmiş 3D hücre kültürü, atık su analizi ve floresan mikroskobunu birleştirmeye yönelik olarak uyarlanmıştır 3,6,8. Model, dokuda yerleşik bağışıklık hücrelerini ve canlı mikroorganizmaların konakçı doku ile doğrudan temasını içerir, bu da yayınlanan diğer modellere kıyasla bir avantajdır9. Ayrıca, epitel hücreleri, canlı bir mikrobiyota ile kolonizasyon için fizyolojik olarak ilgili bir arayüz sağlayan üç boyutlu yapılar halinde kendi kendini organize eder6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokol, çip üzerinde immünokompetan bir bağırsak modeli oluşturmak için gerekli adımları detaylandırır. İmmünofloresan mikroskobu, sitokin ve metabolit analizi, akış sitometrisi, protein ve genetik analiz ve geçirgenlik ölçümü gibi spesifik teknikleri ve olası okuma yöntemlerini tanımladık.
Açıklanan model,daha önce tarif edildiği gibi, mukus salgılayan, emici, enteroendokrin ve Paneth hücre benzeri popülasyonların y?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, İşbirlikçi Araştırma Merkezi PolyTarget 1278 (proje numarası 316213987) tarafından V.D.W. ve A.S.M. A.F. ve A.S.M. ayrıca Almanya’nın Mükemmeliyet Stratejisi – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860. kapsamında “Balance of the Microverse” Mükemmeliyet Kümesi tarafından sağlanan mali desteği de kabul eder. Astrid Tannert ve Jena Biyofotonik ve Görüntüleme Laboratuvarı’na (JBIL) konfokal lazer tarama mikroskobu ZEISS LSM980’e erişim sağladıkları için teşekkür ederiz. Şekil 1C ve Şekil 2 Biorender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
Referanslar
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285 (2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013 (2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012 (2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374 (2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396 (2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525 (2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535 (2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an ‘airway barrier on a chip’. Organs-on-a-Chip. 5, 10025 (2023).
