Özet

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

Published: May 24, 2024
doi:

Özet

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

Abstract

상피 3D 기관형 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조를 재현하는 고급 intestine-on-chip 모델이 개발되었습니다. 면역 역량 모델에는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), Caco-2 장 상피 세포, 조직 거주 대식세포 및 수지상 세포가 포함되며, 이들은 인간 장 점막의 특성을 반영하여 조직 내에서 자체 조직화됩니다. 이 플랫폼의 독특한 측면은 순환하는 인간 1차 면역 세포를 통합하여 생리학적 관련성을 향상시키는 능력입니다. 이 모델은 박테리아 및 진균 집락 형성 및 감염에 대한 장 면역 체계의 반응을 조사하도록 설계되었습니다. 확대된 캐비티 크기로 인해 이 모델은 투과 분석, 사이토카인 방출 및 면역 세포 침투와 같은 다양한 기능적 판독을 제공하며 상피 세포층에 의해 형성된 3D 구조의 면역형광 측정과 호환됩니다. 이를 통해 세포 분화 및 기능에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. intestine-on-chip 플랫폼은 미세생리학적 관류 바이오칩 플랫폼 내에서 살아있는 미생물군의 대리모와 인간 숙주 조직 간의 복잡한 상호 작용을 규명할 수 있는 잠재력을 입증했습니다.

Introduction

OoC(Organ-on-Chip) 시스템은 기존의 2D 세포 배양과 동물 모델 간의 격차를 해소할 수 있는 새로운 3D 세포 배양 기술입니다. OoC 플랫폼은 일반적으로 멤브레인 또는 하이드로겔과 같은 다양한 골격체에서 성장한 조직 특이적 세포를 포함하는 하나 이상의 구획으로 구성됩니다1. 이 모델은 하나 이상의 정의된 유기형 기능을 모방할 수 있습니다. 펌프는 세포 배양 배지의 지속적인 미세유체 관류를 가능하게 하여 세포 폐기물을 제거하고, 세포 분화 개선을 위한 영양 및 성장 인자를 공급하고, 필수적인 생체 내 조건을 재현할 수 있습니다. 면역 세포의 통합으로 OoC 시스템은 in vitro2에서 인간의 면역 반응을 모방할 수 있습니다. 현재까지 다양한 장기와 기능 단위가 제시되었습니다1. 이러한 시스템에는 약물 검사(drug testing)5,7 및 감염 연구(infection studies)6,8를 위해 촉진될 수 있는 혈관구조(vasculature)3, 폐4, 간(liver)2,5 및 장(intestine)6의 모델이 포함된다.

여기에서는 인간 상피 세포를 통합하는 인간 장 온 칩 모델을 제시하며, 내피 내벽 및 조직 상주 대식세포와 결합된 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조의 유기체형 3D 지형을 형성합니다. 이 모델은 미세한 슬라이드 형태의 미세유체 관류 바이오칩에서 배양됩니다. 각 바이오칩은 두 개의 개별 미세유체 공동으로 구성됩니다. 각 캐비티는 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인에 의해 상부 및 하부 챔버로 나뉩니다. 멤브레인 자체는 세포가 양쪽에서 자랄 수 있는 발판 역할도 합니다. 막의 기공은 세포 누화와 세포층 사이의 세포 이동을 가능하게 합니다. 각 챔버는 두 개의 암형 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 접근할 수 있습니다. 선택적으로, 추가적인 미니 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 상부 또는 하부 챔버에 접근할 수 있습니다(그림 1).

OoC 플랫폼은 단일 실험에서 얻을 수 있는 여러 판독값을 제공합니다. Intestine-on-Chip은 관류 3D 세포 배양, 유출물 분석 및 형광 현미경을 결합하여 세포 마커 발현, 대사 속도, 면역 반응, 미생물 집락 형성 및 감염, 장벽 기능 3,6,8을 평가하도록 맞춤화되었습니다. 이 모델에는 조직에 상주하는 면역 세포와 살아있는 미생물이 숙주 조직과 직접 접촉하는 것이 포함되는데, 이는 발표된 다른 모델에 비해 이점이 있다9. 또한, 상피세포는 3차원 구조로 자가조직화되어 살아있는 미생물군(living microbiota)과의 집락화에 생리학적으로 유의미한 인터페이스를 제공한다6.

Protocol

이 프로토콜은 1차 인간 단핵구를 분리하기 위해 건강한 기증자로부터 바이오칩당 ~20mL의 신선한 혈액에 접근해야 합니다. 모든 기증자는 이 연구에 참여하기 위해 정보에 입각한 서면 동의서를 제출했으며, 이 동의는 예나 대학병원 윤리 위원회(허가 번호 2018-1052-BO)의 승인을 받았습니다. 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 모든 용액 및 매체의 구성에 대한 자세한 …

Representative Results

이러한 대표적인 결과는 intestine-on-chip 모델의 뚜렷한 조직층을 보여줍니다. 이들은 프로토콜 섹션 11에 설명된 대로 면역형광 염색됩니다. 이미지는 epifluorescence 또는 confocal fluorescence microscope를 사용하여 z-stack으로 촬영하고 직교 투영으로 처리했습니다. 현미경 설정 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 Table of Materials 를 참조하십시오. 그림 5 는 HUVEC과 대식세?…

Discussion

제시된 프로토콜은 면역 능력이 있는 장-온-칩 모델을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다. 면역형광 현미경 검사, 사이토카인 및 대사산물 분석, 유세포 분석, 단백질 및 유전자 분석, 투과성 측정과 같은 특정 기술과 가능한 판독 방법을 설명했습니다.

기술된 모델은 6,14 이전에 기술된 바와 같이 점액 분비, 흡수성, 장?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 V.D.W.와 A.S.M. 및 A.S.M. A.F. 및 A.S.M.에 대한 공동 연구 센터 PolyTarget 1278(프로젝트 번호 316213987)의 재정 지원을 받았으며, 독일의 Excellence Strategy – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860에 따른 Cluster of Excellence “Balance of the Microverse”의 재정 지원을 인정합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 ZEISS LSM980을 사용할 수 있도록 지원해 준 Astrid Tannert와 Jena Biophotonic and Imaging Laboratory(JBIL)에 감사드립니다. 그림 1C그림 2 는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

Materials

96-well plate black, clear bottom Thermo Fisher 10000631 Consumables
Acetic acid Roth 3738.4 Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) Jackson Immuno Research 715-545-150 Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research 711-605-152 Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen A31573 Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s camera Zeiss 426540-9901-000 Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-free Promocell C-22225 Cell culture consumables
Biochip Dynamic 42 BC002 Microfluidic consumables
BSA fraction V Gibco 15260-037 Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2) ATCC CRL-2102 Epithelial Cell Source
Chloroform Sigma C2432 Chemicals
CO2 Incubator Heracell 150i Technical equipment
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533 Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) Menzel-Gläser 15747592 Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research 705-165-147 Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) Jackson Immuno Research 712-165-150 Secondary Antibody Epithelial Staining
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen D3571 Vascular and Epithelial Staining
Descosept PUR Dr.Schuhmacher 00-323-100 Cell culture consumables
DMEM high glucose Gibco 41965-062 Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol red Gibco 31053028 Cell culture consumables
DPBS (-/-) Gibco 14190-169 Cell culture consumables
DPBS (+/+) Gibco 14040-133 Cell culture consumables
EDTA solution Invitrogen 15575-038 Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium Promocell C-22020 Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix Promocell C-39225 Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenatured Nordbrand-Nordhausen 410 Chemicals
Fetal bovine Serum invitrogen 10270106 Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) Sigma Aldrich FD4-100MG Chemicals
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023 Chemicals
Gentamycin (10mg/mL) Sigma Aldrich G1272 Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050061 Cell culture consumables
Histopaque Sigma-Aldrich 10771 Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342 Sigma-Aldrich 14533 Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma Millipore 616397 Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSF Peprotech 300-30 Cell culture consumables
Human recombinant M-CSF Peprotech 300-25 Cell culture consumables
Illumination device Zeiss HXP 120 C Fluorescence Microscope Setup
Laser Scanning Microscope Zeiss CLSM980 Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochloride Sigma-Aldrich L5647 Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630 Cell culture consumables
Loftex Wipes Loftex 1250115 Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL) Falcon 352052 Consumables
Luer adapter for the top cap (M) Mo Bi Tec M3003 Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque Microfluidic chipshop 09-0556-0336-09 Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140 Cell culture consumables
Methanol Roth 8388.2 Chemicals
Microscope Zeiss Axio Observer 5 Fluorescence Microscope Setup
Microscope slides Menzel MZ-0002 Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 14-0688-82 Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) Sigma-Aldrich, Millipore MABT26 Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate reader Thermo Fisher 51119300 Technical equipment
Normal donkey serum Biozol LIN-END9010-10 Chemicals
Optical Sectioning Zeiss ApoTome Fluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 Cell culture consumables
Plugs Cole Parmer GZ-45555-56 Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody R&D Systems AF938 Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody Dako A0082 Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 61-7300 Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply Microscope Zeiss Eplax Vp232 Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscope Zeiss 415510-1101-000 Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pump Ismatec ISM4412 Technical equipment
SAHA (Vorinostat) Sigma Aldrich SML0061-25MG Chemicals
Saponin Fluka 47036 Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel Sarstedt 01.1602 Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3E Sarstedt 02.1066.001 Consumables
Sodium Pyruvate Gibco 11360-088 Cell culture consumables
Tank 4.5 mL ChipShop 10000079 Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4% Invitrogen T10282 Cell culture consumables
Trypsin Gibco 11538876 Cell culture consumables
Tubing Dynamic 42 ST001 Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) Roth K343.1 Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen W32464 Epithelial Staining
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile Greiner Bio-One 662 160 Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile Greiner Bio-One 657 160 Consumables
Zen Blue Software Zeiss Version 3.7 Microscopy Software

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Feile, A., Wegner, V. D., Raasch, M., Mosig, A. S. Immunocompetent Intestine-on-Chip Model for Analyzing Gut Mucosal Immune Responses. J. Vis. Exp. (207), e66603, doi:10.3791/66603 (2024).

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