Modelo inmunocompetente de intestino en chip para analizar las respuestas inmunitarias de la mucosa intestinal
Özet
Nuestro protocolo detallado describe la creación y el uso del modelo avanzado de intestino en chip, que simula la mucosa intestinal humana con estructuras 3D y varios tipos de células, lo que permite un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias y las funciones celulares en respuesta a la colonización microbiana.
Abstract
Se ha desarrollado un modelo avanzado de intestino en chip que recrea estructuras epiteliales organotípicas en 3D, vellosidades y criptas. El modelo inmunocompetente incluye células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), células epiteliales intestinales Caco-2, macrófagos residentes en el tejido y células dendríticas, que se autoorganizan dentro del tejido, reflejando las características de la mucosa intestinal humana. Un aspecto único de esta plataforma es su capacidad para integrar células inmunitarias primarias humanas circulantes, lo que mejora la relevancia fisiológica. El modelo está diseñado para investigar la respuesta del sistema inmunitario intestinal a la colonización e infección bacteriana y fúngica. Debido al tamaño de su cavidad ampliada, el modelo ofrece diversas lecturas funcionales, como ensayos de permeación, liberación de citocinas e infiltración de células inmunitarias, y es compatible con la medición de inmunofluorescencia de estructuras 3D formadas por la capa de células epiteliales. Por lo tanto, proporciona información completa sobre la diferenciación y la función celular. La plataforma de intestino en chip ha demostrado su potencial para dilucidar interacciones complejas entre sustitutos de una microbiota viva y tejido huésped humano dentro de una plataforma de biochip microfisiológico perfundido.
Introduction
Los sistemas Organ-on-Chip (OoC) representan una técnica emergente de cultivo celular en 3D que es capaz de cerrar la brecha entre el cultivo celular 2D convencional y los modelos animales. Las plataformas OoC suelen consistir en uno o más compartimentos que contienen células específicas de tejido cultivadas en una amplia gama de andamios, como membranas o hidrogeles1. Los modelos son capaces de imitar una o más funciones organotípicas definidas. Las bombas permiten la perfusión microfluídica continua del medio de cultivo celular para la eliminación de productos de desecho celular, el suministro de factores de nutrición y crecimiento para mejorar la diferenciación celular y la recreación de condiciones esenciales in vivo. Con la integración de células inmunitarias, los sistemas OoC pueden imitar la respuesta inmunitaria humana in vitro2. Hasta la fecha, se ha presentado una amplia gama de órganos y unidades funcionales1. Estos sistemas incluyen modelos de la vasculatura3, el pulmón4, el hígado 2,5 y el intestino6 que pueden facilitarse para las pruebas de drogas 5,7 y los estudios de infección 6,8.
Aquí presentamos un modelo de intestino humano en chip que integra células epiteliales humanas formando una topografía organotípica en 3D de estructuras en forma de vellosidades y criptas combinadas con un revestimiento endotelial y macrófagos residentes en los tejidos. El modelo se cultiva en un biochip perfundido microfluídicamente en formato de portaobjetos microscópico. Cada biochip consta de dos cavidades microfluídicas separadas. Cada cavidad está dividida por una membrana porosa de tereftalato de polietileno (PET) en una cámara superior e inferior. La membrana en sí también sirve como andamio para que las células crezcan a cada lado. Los poros de la membrana permiten la diafonía celular y la migración celular entre las capas celulares. Se puede acceder a cada cámara por dos puertos hembra del tamaño de una cerradura Luer. Opcionalmente, un puerto adicional del tamaño de una cerradura mini-luer puede proporcionar acceso a la cámara superior o inferior (Figura 1).
La plataforma OoC ofrece una serie de lecturas que se pueden obtener de un solo experimento. El intestino en chip está diseñado para combinar el cultivo de células 3D perfundidas, el análisis de efluentes y la microscopía de fluorescencia para evaluar la expresión de marcadores celulares, las tasas de metabolización, la respuesta inmunitaria, la colonización e infección microbiana y la función de barrera 3,6,8. El modelo incluye células inmunitarias residentes en los tejidos y el contacto directo de microorganismos vivos con el tejido del huésped, lo que supone una ventaja en comparación con otros modelos publicados9. Además, las células epiteliales se autoorganizan en estructuras tridimensionales que proporcionan una interfaz fisiológicamente relevante para la colonización con una microbiota viva6.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado detalla los pasos necesarios para generar un modelo de intestino en chip inmunocompetente. Describimos técnicas específicas y posibles métodos de lectura, como la microscopía de inmunofluorescencia, el análisis de citocinas y metabolitos, la citometría de flujo, el análisis genético y de proteínas y la medición de la permeabilidad.
El modelo descrito consiste en HUVECs primarios, macrófagos derivados de monocitos y células dendríticas derivadas de monocitos…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo contó con el apoyo financiero del Centro de Investigación Colaborativa PolyTarget 1278 (proyecto número 316213987) para que V.D.W. y A.S.M. A.F. y A.S.M. reconozcan además el apoyo financiero del Clúster de Excelencia “Balance of the Microverse” en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860. Queremos agradecer a Astrid Tannert y al Laboratorio de Biofotónica e Imagen de Jena (JBIL) por proporcionarnos acceso a su microscopio de barrido láser confocal ZEISS LSM980. La Figura 1C y la Figura 2 se crearon con Biorender.com.
Materials
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
Referanslar
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