Иммунокомпетентная модель кишечника на чипе для анализа иммунных реакций слизистой оболочки кишечника
Özet
В нашем подробном протоколе описывается создание и использование усовершенствованной модели кишечника на чипе, которая имитирует слизистую оболочку кишечника человека с помощью 3D-структур и различных типов клеток, что позволяет проводить глубокий анализ иммунных реакций и клеточных функций в ответ на микробную колонизацию.
Abstract
Разработана усовершенствованная модель кишечника на чипе, воссоздающая эпителиальные 3D-органотипические структуры, похожие на ворсинки и крипты. Иммунокомпетентная модель включает эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVEC), эпителиальные клетки кишечника Caco-2, тканевые резидентные макрофаги и дендритные клетки, которые самоорганизуются в ткани, отражая характеристики слизистой оболочки кишечника человека. Уникальным аспектом этой платформы является ее способность интегрировать циркулирующие первичные иммунные клетки человека, повышая физиологическую значимость. Модель предназначена для изучения реакции иммунной системы кишечника на бактериальную и грибковую колонизацию и инфекцию. Благодаря увеличенному размеру полости модель предлагает различные функциональные показания, такие как анализы проникновения, высвобождения цитокинов и инфильтрации иммунных клеток, а также совместима с иммунофлуоресцентным измерением 3D-структур, образованных слоем эпителиальных клеток. Таким образом, он дает всестороннее представление о дифференцировке и функционировании клеток. Платформа «кишечник-на-чипе» продемонстрировала свой потенциал в выяснении сложных взаимодействий между суррогатами живой микробиоты и тканью хозяина человека в рамках платформы микрофизиологических перфузированных биочипов.
Introduction
Системы «орган на чипе» (OoC) представляют собой новую технологию 3D-клеточной культуры, способную преодолеть разрыв между традиционной 2D-культурой клеток и животными моделями. Платформы OoC обычно состоят из одного или нескольких компартментов, содержащих тканеспецифические клетки, выращенные на широком спектре каркасов, таких как мембраны или гидрогели1. Модели способны имитировать одну или несколько определенных органотипических функций. Насосы обеспечивают непрерывную микрофлюидную перфузию среды для клеточных культур для удаления продуктов клеточных отходов, снабжения питательными веществами и факторами роста для улучшения клеточной дифференцировки, а также для воссоздания необходимых условий in vivo. Благодаря интеграции иммунных клеток, системы OoC могут имитировать иммунный ответ человека in vitro2. На сегодняшний день представлен широкий спектр органов и функциональных единиц1. Эти системы включают модели сосудистой сети3, легких4, печени 2,5 и кишечника 6, которые могут быть облегчены для тестирования лекарств 5,7 и исследований инфекций 6,8.
В данной работе мы представляем модель кишечника на чипе человека, объединяющую эпителиальные клетки человека, формирующую органотипическую 3D-топографию ворсинчатых и криптоподобных структур в сочетании с эндотелиальной выстилкой и тканевыми резидентными макрофагами. Модель культивируется в микрофлюидно перфузированном биочипе в формате микроскопического предметного стекла. Каждый биочип состоит из двух отдельных микрофлюидных полостей. Каждая полость разделена пористой мембраной из полиэтилентерефталата (ПЭТ) на верхнюю и нижнюю камеры. Сама мембрана также служит каркасом для роста клеток с каждой стороны. Поры мембраны обеспечивают клеточные перекрестные помехи и миграцию клеток между клеточными слоями. Доступ к каждой камере осуществляется через два порта с гнездовым замком Люэра. Опционально дополнительный порт размером с замок мини-люэра может обеспечить доступ к верхней или нижней камере (рис. 1).
Платформа OoC предлагает ряд показаний, которые могут быть получены в результате одного эксперимента. Кишечник-на-чипе предназначен для объединения перфузионной 3D-культуры клеток, анализа сточных вод и флуоресцентной микроскопии для оценки экспрессии клеточных маркеров, скорости метаболизма, иммунного ответа, микробной колонизации и инфекции, а также барьерной функции 3,6,8. Модель включает в себя тканевые резидентные иммунные клетки и прямой контакт живых микроорганизмов с тканью хозяина, что является преимуществом по сравнению с другими опубликованными моделями9. Кроме того, эпителиальные клетки самоорганизуются в трехмерные структуры, которые обеспечивают физиологически релевантный интерфейс для колонизации живой микробиотой6.
Protocol
Representative Results
Discussion
В представленном протоколе подробно описаны необходимые шаги для создания иммунокомпетентной модели кишечника на чипе. Мы описали конкретные методы и возможные методы считывания, такие как иммунофлуоресцентная микроскопия, анализ цитокинов и метаболитов, проточная цитометрия, белк?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была выполнена при финансовой поддержке Центра совместных исследований PolyTarget 1278 (номер проекта 316213987) для V.D.W. и A.S.M. A.F. и A.S.M. также выражают финансовую поддержку со стороны Кластера передового опыта «Баланс микровселенной» в соответствии со стратегией превосходства Германии – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860. Мы выражаем признательность Астрид Таннерт и Йенской лаборатории биофотоники и визуализации (JBIL) за предоставленный нам доступ к их конфокальному лазерному сканирующему микроскопу ZEISS LSM980. Рисунок 1C и рисунок 2 были созданы с помощью Biorender.com.
Materials
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
Referanslar
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285 (2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013 (2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012 (2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374 (2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396 (2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525 (2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535 (2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an ‘airway barrier on a chip’. Organs-on-a-Chip. 5, 10025 (2023).
