نموذج الأمعاء على الرقاقة المناعي لتحليل الاستجابات المناعية المخاطية للأمعاء
Özet
يحدد بروتوكولنا التفصيلي إنشاء واستخدام نموذج الأمعاء على الرقاقة المتقدم ، والذي يحاكي الغشاء المخاطي المعوي البشري مع هياكل 3D وأنواع الخلايا المختلفة ، مما يتيح التحليل المتعمق للاستجابات المناعية والوظائف الخلوية استجابة للاستعمار الميكروبي.
Abstract
تم تطوير نموذج متقدم للأمعاء على الرقاقة يعيد إنشاء هياكل ظهارية 3D تشبه الزغابات العضوية وتشبه السرداب. يشمل نموذج الكفاءة المناعية الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) ، والخلايا الظهارية المعوية Caco-2 ، والبلاعم المقيمة في الأنسجة ، والخلايا المتغصنة ، التي تنظم نفسها ذاتيا داخل الأنسجة ، وتعكس خصائص الغشاء المخاطي المعوي البشري. يتمثل أحد الجوانب الفريدة لهذه المنصة في قدرتها على دمج الخلايا المناعية الأولية البشرية المنتشرة ، مما يعزز الأهمية الفسيولوجية. تم تصميم النموذج للتحقيق في استجابة الجهاز المناعي المعوي للاستعمار والعدوى البكتيرية والفطرية. نظرا لحجم تجويفه الموسع ، يقدم النموذج قراءات وظيفية متنوعة مثل مقايسات التخلل ، وإطلاق السيتوكين ، وتسلل الخلايا المناعية ، وهو متوافق مع قياس التألق المناعي لهياكل 3D التي شكلتها طبقة الخلايا الظهارية. يوفر بموجب هذا رؤى شاملة حول تمايز الخلايا ووظيفتها. أثبتت منصة الأمعاء على الرقاقة إمكاناتها في توضيح التفاعلات المعقدة بين بدائل الجراثيم الحية والأنسجة المضيفة البشرية داخل منصة رقاقة حيوية فسيولوجية دقيقة.
Introduction
تمثل أنظمة Organ-on-Chip (OoC) تقنية ناشئة لثقافة الخلايا 3D القادرة على سد الفجوة بين زراعة الخلايا 2D التقليدية والنماذج الحيوانية. تتكون منصات OoC عادة من حجرة واحدة أو أكثر تحتوي على خلايا خاصة بالأنسجة تنمو على مجموعة واسعة من السقالات مثل الأغشية أو الهلاميات المائية1. النماذج قادرة على محاكاة واحدة أو أكثر من وظائف النمط العضوي المحددة. تتيح المضخات التروية الدقيقة المستمرة لوسط زراعة الخلايا لإزالة الفضلات الخلوية ، وتزويدها بعوامل التغذية والنمو لتحسين التمايز الخلوي ، وإعادة إنشاء الظروف الأساسية في الجسم الحي. مع تكامل الخلايا المناعية ، يمكن لأنظمة OoC محاكاة الاستجابة المناعية البشرية في المختبر2. حتى الآن ، تم تقديم مجموعة واسعة من الأجهزة والوحدات الوظيفية1. وتشمل هذه الأنظمة نماذج من الأوعية الدموية3 والرئة4 والكبد 2,5 والأمعاء6 التي يمكن تسهيلها لاختبار المخدرات 5,7 ودراسات العدوى 6,8.
نقدم هنا نموذجا للأمعاء البشرية على الرقاقة يدمج الخلايا الظهارية البشرية التي تشكل تضاريس 3D العضوية للهياكل الشبيهة بالزغابات والشبيهة بالقبو جنبا إلى جنب مع بطانة البطانة والبلاعم المقيمة في الأنسجة. يتم استزراع النموذج في رقاقة حيوية مائعة دقيقة في شكل شريحة مجهرية. تتكون كل رقاقة حيوية من تجويفين منفصلين للسوائع الدقيقة. ينقسم كل تجويف بواسطة غشاء بولي إيثيلين تيريفثاليت مسامي (PET) إلى غرفة علوية وسفلية. يعمل الغشاء نفسه أيضا كسقالة لنمو الخلايا على كل جانب. تتيح مسام الغشاء الحديث الخلوي وهجرة الخلايا بين طبقات الخلايا. يمكن الوصول إلى كل غرفة عن طريق منفذين بحجم قفل luer. اختياريا ، يمكن أن يوفر منفذ إضافي بحجم قفل صغير الوصول إلى الغرفة العلوية أو السفلية (الشكل 1).
تقدم منصة OoC عددا من القراءات التي يمكن الحصول عليها من تجربة واحدة. تم تصميم الأمعاء على الرقاقة من أجل الجمع بين ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد المثقوبة ، وتحليل النفايات السائلة ، والفحص المجهري الفلوري لتقييم تعبير علامة الخلية ، ومعدلات الأيض ، والاستجابة المناعية ، والاستعمار الميكروبي والعدوى ، ووظيفة الحاجز3،6،8. يتضمن النموذج الخلايا المناعية المقيمة في الأنسجة والاتصال المباشر للكائنات الحية الدقيقة مع الأنسجة المضيفة ، وهي فائدة مقارنة بالنماذج المنشورةالأخرى 9. علاوة على ذلك ، تنظم الخلايا الظهارية نفسها في هياكل ثلاثية الأبعاد توفر واجهة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية للاستعمار مع ميكروبيوتا حية6.
Protocol
Representative Results
Discussion
يفصل البروتوكول المقدم الخطوات اللازمة لتوليد نموذج الأمعاء على الرقاقة المناعي. وصفنا تقنيات محددة وطرق قراءات محتملة مثل الفحص المجهري المناعي ، وتحليل السيتوكين والأيض ، وقياس التدفق الخلوي ، والبروتين والتحليل الجيني ، وقياس النفاذية.
يتكون النموذج الموصوف من HUVECs ال?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل ماليا من قبل مركز الأبحاث التعاونية PolyTarget 1278 (رقم المشروع 316213987) إلى V.D.W. و A.S.M. A.F. و A.S.M. كما أقر بالدعم المالي من قبل مجموعة التميز “توازن الكون الدقيق” في إطار استراتيجية التميز الألمانية – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860. نود أن نعرب عن تقديرنا لأستريد تانرت ومختبر جينا للتصوير الحيوي والتصوير (JBIL) لتزويدنا بالوصول إلى مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ZEISS LSM980. تم إنشاء الشكل 1C والشكل 2 باستخدام Biorender.com.
Materials
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
Referanslar
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285 (2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013 (2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012 (2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374 (2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396 (2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420 (2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525 (2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535 (2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an ‘airway barrier on a chip’. Organs-on-a-Chip. 5, 10025 (2023).
